丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶免疫分析方法的研究

摘要

目的：建立化学发光酶免疫方法(CLIA)检测外周血中的HCV核心抗原，并对该方法的敏感度、特异性、稳定性等方面进行研究。 方法：采用HCV核心抗原特异性单克隆抗体固相包被，辣根过氧过物酶(HRP)标记另一株特异性单抗，以鲁米诺为发光底物，采用双抗体夹心法检测血样中的HCV核心抗原。利用酶标技术对HCV核心抗原的单克隆抗体进行标记，运用抗原抗体分离技术对样品中已形成复合物的抗原进行分离，摸索发光底物的最佳成份及浓度。 在相同实验条件下，经过多次比较实验确定HCV核心抗原特异性单克隆抗体的包被缓冲液的种类、包被浓度和包被体积；确定酶标抗体的工作浓度；发光底物的氧化剂、发光剂的最佳浓度的选择，增强剂的种类的确定和浓度的选择；自配发光底物和购买发光底物在发光持续性等方面进行比较；反应体系初步建立后，检测体系的敏感度，特异性、线性范围及变异系数等指标；采用CLIA和ELISA两种方法同时检测1，000例临床标本，对其敏感性与特异性进行比较。 结果：经过多次比较实验确定包被缓冲液为pH4.6的醋酸盐缓冲液，包被浓度为5μg/mL，包被体积为100μL/well；酶标记抗体的工作浓度为1:1000；发光底物发光剂为鲁米诺，浓度为3mmol/L；氧化剂为双氧水，最佳浓度为7 mmol/L；增强剂为对碘苯酚，浓度0.3 mmol/L；自配的发光底物和购买的化光底物同时检测一批标本，购买发光底物阳性发光值高于自制底物，但是阴性发光值和本底也高于自制底物，且发光持续性方面大体相同；该体系敏感度为0.4ng/mL，线性范围为0-20ng/mL，批内变异系数<8％，批间变异系数<10％；和ELISA法同时检测1，000例临床标本，ELISA法检测出25例阳性，CLIA法检测出33例阳性，这33例阳性标本中有23例为ELISA阳性者；用PCR方法检测ELISA阳性标本，结果与CLIA法一致，23例阳性，2例阴性；用PCR法检测CLIA阳性标本，其结果完全一致，经统计学分析CLIA法对HCV核心抗原检出率高于ELISA法。 结论： (1)研制出了HRP催化的最佳发光底物，经证实此发光底物发光性能持续稳定，发光峰值适当，可达到临床应用的要求。 (2)初步建立了HCV核心抗原的化学发光检测体系，此体系敏感度高，特异性强，稳定性好，适合临床检测应用。