缺口酶依赖的DNA链置换扩增技术的研究

摘要

背景与目的：
　　近年来核酸等温扩增技术迅猛发展，显现出广阔的应用前景。链置换扩增技术是一种快速、灵敏、特异的DNA等温扩增方法，但硫修饰的dNTP的掺入限制了其在分子生物学领域的应用范围。缺口酶是一种能在天然DNA特异序列内部或附近产生单链缺口，而对底物不需要任何修饰的限制性内切酶。本研究对链置换扩增技术进行革新，以缺口酶取代普通限制性内切酶与 dNTP[αS]掺入，提出了缺口酶依赖的DNA链置换扩增技术(nickase-dependent DNA strand displacement amplification)，使其适用于基层医疗卫生单位，用于某些疾病及病原体的检测。
　　方法：
　　1）以Lambda DNA或pUC18质粒DNA为模板扩增短目的片段，初步建立合适的扩增体系，摸索包括聚合酶与切口酶的相对用量，引物与模板的相对用量，反应条件（温度、时间、离子强度、pH值）等。
　　2）以上述工作为基础探讨扩增较长目的片段（＞500 bp）的可能性。
　　3）分别以人全基因组DNA，淋球菌基因组DNA和白色念珠菌基因组DNA为模板扩增特异性片段。
　　结果：
　　1）以Lambda DNA为模板扩增出131/133 bp片段，优化条件建立了最适的短片段扩增体系；
　　2）以Lambda DNA为模板扩增出200 bp，500 bp产物片段；
　　3）以pUC18质粒DNA为模板扩增出500 bp产物片段；
　　4）以Lambda DNA为模板扩增出1.2 kb产物片段，但产量及纯度有待改进。
　　5）以人全基因组DNA，淋球菌基因组DNA和白色念珠菌基因组DNA为模板扩增，电泳未见单一目的片段。
　　结论：
　　1）本研究将缺口酶与链置换扩增技术相结合新创的缺口酶依赖的DNA链置换扩增（NDA）体系能以Lambda DNA及pUC18 DNA为模板快速敏感有效地扩增短目的片段。
　　2）NDA体系扩增短目的片段其合适的扩增条件是：25μL反应体系中，dNTP终浓度为0.4μM， primers为1μM，NaCl为100 mM，Bst DNA polymerase Large Fragment用量为8 U，Nt.BstNBI为2 U，反应温度为55℃，反应时间为15-30 min；
　　3）NDA方法有扩增较长（＞500 bp）片段的可能，但是对于复杂基因组DNA，反应体系尚需进一步改进。

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前 言

1 实验材料

1.1主要试剂

1.2仪器设备

1.3 溶液配制

2 实验方法

2.1 以λDNA为模板扩增131/133 bp片段

2.2以λDNA为模板扩增约200 bp片段

2.3以λDNA为模板扩增约500 bp片段

2.4 以pUC18 DNA为模板扩增500 bp片段

2.5以λDNA为模板扩增约1.2 kb片段

2.6 以全基因组DNA为模板扩增特异目的片段

2.7 反应体系动态变化的监测

3.实验结果

3.1 从λDNA中扩增131/133 bp产物

3.2 NDA方法的其他扩增产物

3.3 以基因组DNA为模板扩增的产物

3.4 反应体系动态变化的监测

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

已发表的论文

致谢