白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞氧化损伤的影响

摘要

目的：观察甲醛对体外培养的鼠肾上腺嗜铬细胞瘤单克隆细胞系(PC12细胞)的影响，探讨甲醛损伤PC12细胞的作用机制；观察白藜芦醇(Resveratrol,Res)预处理对甲醛所致PC12细胞损伤的影响，研究其可能的作用机制。
　　方法：
　　1.甲醛对体外培养鼠肾上腺嗜铬细胞瘤单克隆细胞系(PC12细胞)的损伤及其机制研究：体外常规培养PC12细胞，取对数生长期的细胞进行实验。实验设空白对照组和甲醛损伤组(终浓度为10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L，160μmol/L)加药后培养24h。采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法检测细胞活力，分光光度法测定LDH漏出量，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，二硫对二硝基苯甲酸(DTNB)比色法测定GSH-Px活性，硝酸还原酶法检测NO浓度及一氧化氮合酶(iNOS)活性的变化，以观察甲醛对细胞氧化/抗氧化系统的影响；收集各组细胞，检测细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)蛋白活性及细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)mRNA的表达，并采用Hoechst33258荧光染色法和流式细胞技术检查细胞凋亡情况，以阐明甲醛对PC12细胞线粒体的损伤机制。
　　2.白藜芦醇对甲醛致PC12细胞损伤的保护及其机制研究：设正常细胞组、溶媒组(2‰DMSO)、甲醛损伤组(80μmol/L)、白藜芦醇组(6.25μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L)、氨基胍组(100μmol/L)。其中白藜芦醇与细胞预孵2h后加入甲醛(终浓度80μmol/L)置孵箱培养24h，检测细胞培养液中LDH、MDA、NO含量以及SOD、GSH-Px、iNOS活性，并收集各组细胞，检测细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)蛋白活性及细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)mRNA的表达；Hoechst33258荧光染色法及流式细胞技术检测细胞凋亡；观察白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞损伤的可能保护机制。SPSS13.0进行统计学分析，SigmaPlot10.0作图。
　　结果：
　　1.甲醛可造成PC12细胞损伤，导致细胞膜破裂，LDH释放增多；
　　2.甲醛可致MDA增加，SOD、GSH-Px减少，与空白对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；
　　3.甲醛组NO含量及NOS、iNOS活性明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
　　4.甲醛组细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)蛋白活性低于空白对照组且mRNA的表达较空白对照组明显减弱；
　　5.白藜芦醇组LDH、MDA、NO含量及NOS、iNOS活性低于甲醛组(80μmol/L)，而SOD、GSH-Px活性高于甲醛组，差异均有统计学意义(P<0.05)；并呈剂量-效应关系；细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)蛋白活性及mRNA表达与甲醛组相比明显增高。Hoechst33258荧光染色法及流式细胞技术显示白藜芦醇能有效地改善甲醛所致PC12细胞的氧化损伤，降低凋亡率。
　　结论：
　　1、白藜芦醇对甲醛诱导的PC12细胞氧化损伤具有保护作用，在6.25~100μmol/L浓度范围内其保护效应呈剂量-效应关系；
　　2、甲醛通过ROS/氧化应激、NOS/NO/自由基途径诱导线粒体损伤，使COⅡ结构改变致线粒体内细胞色素C的释放，引起线粒体内活性氧增多，导致PC12细胞凋亡。
　　3、白藜芦醇通过抑制ROS/氧化应激、NOS/NO/自由基途径，激活COⅡ表达，降低PC12细胞色素C的释放量，减轻对线粒体的损伤，降低PC12细胞凋亡率。

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正 文

前 言

材料和方法

1. 材料

2. 方法

结 果

1. 甲醛诱导PC12细胞的损伤效应

2. 白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞损伤的干预作用

讨 论

结 论

参考文献

附 录 一

附 录 二

附 录 三

攻读学位期间主要的研究成果

致谢