PRMT2及其剪接体对雌激素受体β转录活性的影响

摘要

目的:比较在不同条件下,PRMT2及其新的剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ对ERβ转录活性的影响;检测PRMT2及PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ与ERβ在细胞外的相互作用。
　　方法:将pcDNA3.0-PRMT2、pcDNA3.0-PRMT2α、pcDNA3.0-PRMT2β、pcDNA3.0-PRMT2γ及pcDNA3.0空载体质粒,分别与pcDNA3.0-ERβ瞬时共转染(采用脂质体介导法)293T细胞,建立萤火虫荧光素酶双报告基因检测系统,选用含受雌激素反应元件(ERE,estrogen response elements)一致序列调控的荧光素酶基因(ERE-Luc)作为报告基因,通过荧光测定仪检测ERE-luc荧光素酶基因活性值,进而观察PRMT2及其剪接体对ERβ转录活性的影响。该部分包括两个内容,其一观察在有无雌激素以及不同浓度雌激素的条件下,PRMT2及PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ质粒分别对ERβ转录活性的影响;其二是观察在选择性雌激素受体调节剂〔ICI182,780(氟维司群)、4-OHT(4-羟基他莫西芬)〕条件下,PRMT2及其各剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ对ERβ转录活性的影响。将表达融合蛋白GST-PRMT2及其剪接体的重组质粒和表达GST的空载体pGEX-5T转化到大肠杆菌BL21中,诱导融合蛋白的表达,将获得的蛋白样本进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色法验证蛋白表达水平。GST-Sepharose4B亲和层析法纯化GST-PRMT2α、GST-PRMT2β、GST-PRMT2γ融合蛋白及GST蛋白,将pcDNA3.0-ERβ瞬时转染293T细胞,收集细胞裂解液,运用GST pull-down技术检测PRMT2及其各剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ与ERβ在细胞外相互作用情况,及其与雌激素的相关性。
　　结果:
　　1、通过双荧光素酶报告基因检测系统检测发现,在雌激素不存在时,PRMT2及其剪接体对ERβ转录活性无明显提高;在雌激素存在时,与空载体相比,PRMT2及其剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ分别使ERβ的转录活性提高了约2.09倍,1.65倍,1.77倍及1.98倍;随着雌激素浓度的提高,PRMT2及其剪接体对ERβ转录活性在10nm处达到高峰,到1000nm其活性被明显抑制;
　　2、分别加入选择性雌激素受体调节剂(ICI182,780,4-OHT),选择性雌激素受体调节剂可降低PRMT2及其剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ对ERβ转录活性。
　　3、通过GST pull-down技术检测发现,无论雌激素是否存在,GST蛋白与ERβ不能结合,而GST-PRMT2α、GST-PRMT2β、GST-PRMT2γ融合蛋白均能分别与ERβ结合,在雌激素存在条件下,结合作用无明显变化。
　　结论:
　　1、PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ与PRMT2一样,在适当浓度雌激素的条件下,能以雌激素依赖的形式提高ERβ转录活性。
　　2、选择性雌激素受体调节剂能降低PRMT2及其各剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ对ERβ转录活性的影响。
　　3、PRMT2及其各剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ在细胞外均能以不依赖于雌激素形式与ERβ相结合,雌激素对其无明显增强效应。

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中文摘要

英文摘要

前言

技术路线

一、PRMT2以及各剪接体对ERβ转录活性影响的相关研究

二、通过GST-pull down技术检测PRMT2及PRMT2α/β/γ与ERβ在体外的相互作用的研究

实 验 材 料

一、实验需要的细胞与质粒

二、实验需要的主要试剂名称及来源

二、实验需要相关试剂的配制

实 验 方 法

一、通过萤火虫荧光素酶双报告基因系统检测PRMT2及其各剪接体对ERβ转录活性影响的研究

二、GST蛋白、GST-PRMT2以及GST-PRMT2α/β/γ融合蛋白的表达。

三、通过GST pull-down技术检测PRMT2及PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ 与ERβ体外相互作用的相关研究。

四、统计学分析

实 验 结 果

一﹑通过萤火虫荧光素酶双报告基因系统检测PRMT2及其各剪接体对ERβ转录活性影响的相关研究

二、GST、GST-PRMT2及各种剪接体GST原核融合蛋白的表达的检测。

三、GST-pull down技术检测PRMT2及剪接体与ERβ体外相互作用。1. ERβ蛋白的检测

讨论

实 验 结 论

参考文献

主要缩略语及英文索引

综述

参考文献

硕士期间发表论文情况

致谢