TLRs在日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿形成中的作用与机制初步研究

摘要

目的：
　　通过构建日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿模型，体内研究TLRs分子的表达及与血吸虫病肝虫卵肉芽肿炎性病变的关系；用SjSEA和SjSWA作为TLRs的PAMPs，体外研究血吸虫抗原对TLRs途径的激活及诱导前炎症细胞因子的表达水平。
　　方法：
　　（1）体内实验：构建日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿Balb/c小鼠模型，FCM和real-time PCR分别检测感染不同时间点小鼠肝组织中TLR2、TLR4蛋白及mRNA表达水平，肝脏组织切片HE、Masson染色观察肝组织病理变化；ELISA检测血清中前炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）的表达，速率法检测ALT/AST变化。
　　（2）体内实验：制备SjSEA和SjSWA，分离纯化与培养pMφ，分别用SjSEA、SjSWA、LPS及PBS在不同时间点刺激pMφ，ELISA检测前炎症细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平，real-time PCR检测TLR2、TLR4mRNA，western blot检测pMφ总蛋白中κB抑制蛋白（IκB），观察NF-κB活化情况。
　　结果：
　　（1）体内实验结果：肝组织切片HE染色及Masson染色观察到肝肉芽肿面积及肝脏胶原沉积随感染时间延长而增加；感染组（2w、4w、6w、8w）与正常对照组（0w）比较，FCM结果显示感染组小鼠肝脏组织TLR2和TLR4表达量显著高于正常对照组，P<0.05，感染8w达峰值（TLR2:95.44±10.35％，TLR4:39.27±3.88%）；real-time PCR结果显示TLR2和TLR4表达量显著高于正常对照组（P<0.05），感染8w达峰值（TLR2:7.14±0.96，TLR4:5.97±0.13）；ELISA结果表明，前炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α和 IL-6）水平显著高于正常对照组（P<0.05），IL-1β含量在感染6w达峰值(234.81±31.7pg/mL)，TNF-α含量在感染4w达峰值(977.1±45.80pg/mL)，IL-6含量在感染8w时达峰值(136.00±14.20pg/mL)；血清ALT和AST值显著高于正常对照组，感染8w达峰值（ALT:149.60±15.30U/L，AST:163.50±21.80U/L）（P<0.05）；相关性分析结果显示，TLR2和TLR4水平与肝虫卵肉芽肿炎症程度、前炎症细胞因子（IL-1β和IL-6）表达和肝脏损伤指标（ALT和AST）呈密切正相关性。
　　（2）体外实验结果：SjSEA、SjSWA在不同时间点（0h、6h、12h、24h）能诱导pMφ产生IL-1β、TNF-α和IL-6，与对照组（PBS）比较有显著性差异，具有统计学意义（P<0.05），当刺激12h时CKs达高峰，SjSEA刺激后IL-1β、TNF-α和IL-6峰值分别为91.90±15.28pg/mL、1350.90±160.28pg/mL和52.71±13.38pg/mL；SjSWA刺激后IL-1β、TNF-α和IL-6峰值分别为107.03±25.19pg/mL，983.43±18.19pg/mL和48.03±11.19pg/mL；real-time PCR结果显示，TLR4 mRNA表达量与对照组比较有显著差异（P<0.01），刺激12h达高峰，SEA刺激后其mRNA含量达10.91±1.32，SWA刺激组为10.14±1.23，TLR2 mRNA在血吸虫抗原刺激组和正常对照组比较无显著变化（P>0.05）；western blot结果显示，SjSEA及SjSWA刺激pMφ30min后IκB水平显著降解，但作用60min后，IκB水平略有升高。
　　结论:
　　（1）TLR2和TLR4分子的表达量与前炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α及IL-6）的分泌、肝受损程度（ALT和AST）和血吸虫病肝虫卵肉芽肿炎性病变程度呈正相关，说明TLR2和TLR4途径可能参与了血吸虫病肝虫卵肉芽肿的形成。
　　（2）SjSEA和SjSWA可能作为TLR4 PAMPs，激活TLR4信号途径，分泌IL-1β、TNF-α及IL-6等前炎性细胞因子。

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主要英文缩略语索引

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前言

材料与方法

1主要实验仪器

2 主要实验试剂及配置

2.1 试剂

2.2 抗体

2.3 培养基及溶液

2.4 其它

2.5 主要液体的配置

3实验动物分组和处理方法

4肝脏组织切片HE染色

5肝脏组织切片Masson染色检测胶原纤维沉积程度

6荧光实时定量PCR检测肝组织TLR2和TLR4 mRNA的表达

6.1 RNA提取

6.2 逆转录反应cDNA

6.3实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)

7流式细胞术检测TLR2、TLR4细胞

8 ELISA检测前炎症细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平

9速率法检测ALT和AST

9.1采用速率法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）

9.2采用速率法检测天门冬氨酸氨基转移酶（AST）

10.日本血吸虫可溶性性抗原制备

10.2 SjSWA的制备

11.小鼠腹腔巨噬细胞（pMφ）的分离纯化与培养

12.BCA蛋白浓度的测定

13.SjSEA和SjSWA体外刺激pMφ

14.活化pMφ的TLR2和TLR4 mRNA的表达

15.ELISA检测前炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平

16.Western blot检测IκB水平

17.统计学处理

实验结果

1肝组织和脾组织病理组织改变

1.1肉芽肿的观察

1.2肝脏组织切片HE染色（图2）

1.3肝脏组织切片Masson染色（图3）：

2.FCM检测肝组织TLR2和TLR4

3. Realtime-PCR检测小鼠肝脏组织TLR2和TLR4 mRNA

4. ELISA检测血清中IL-1β、TNF-α及IL-6

5.速率法检测血清ALT和AST

6. TLR2 和 TLR4 表达量与前炎症细胞因子（IL-1β、TNF-α 及IL-6）表达水平及肝损伤指标（ALT和AST）相关性分析

7. SjSEA和SjSWA诱导pMφ激活TLRs途径

7.1 SjSEA刺激pMφ分泌TNF-α的最佳浓度

8. SjSEA和SjSWA刺激pMφ，TLR2和TLR4 mRNA表达

9. SjSEA和SjSWA刺激pMφ，检测IL-1β、TNF-α及IL-6等前炎性细胞因子水平变化

10. SjSEA，SjSWA对pMφIκB水平的影响

讨论

结论

参考文献

综述

成果目录

致谢