PI3K/Akt/FoxO3a信号通路在FGF-2拮抗心肌细胞凋亡中的作用研究

摘要

目的：探讨FGF-2拮抗氧化应激引起的H9c2心肌细胞凋亡的新机制。
　　方法：
　　1.采用体外培养的H9c2心肌细胞，用不同浓度（0，50，100，200，400μmol/L）的H2O2处理6h，用MTT法筛选出H2O2引起细胞凋亡的最适浓度；用不同浓度（0，2.5，5，10，20ng/ml）的FGF-2与培养的H9c2心肌细胞共同孵育0.5h，再用H2O2刺激6h后，用MTT法筛选FGF-2拮抗H2O2引起的细胞凋亡的最适浓度；
　　2.100μmol/L H2O2处理 H9c2心肌细胞不同时间后，Western blot检测细胞内Akt, p-Akt, FoxO3a, p-FoxO3a和Bim蛋白的表达变化。
　　3.进一步实验分组：(l)对照组：以不含FGF-2的DMEM培养液培养H9c2心肌细胞45min；(2) H2O2组：培养液中加入终浓度为100μmol/L H2O2刺激45min；(3) FGF-2+H2O2组：以含10ng/ml FGF-2的DMEM培养液培养细胞30min后，100μmol/LH2O2刺激45min；(4) FGF-2+H2O2+LY294002（PI3K/Akt信号通路抑制剂）组：以含10 ng/ml FGF-2的DMEM培养液培养细胞30min后，100μmol/L H2O2刺激45min，其中10μmol/L的LY294002在加H2O21h前加入。采用MTT法检测H9c2心肌细胞的活力，Hoechst33258染色、TUNEL染色、流式细胞术检测 H9c2心肌细胞的凋亡率；Western blot检测细胞内Akt, p-Akt, FoxO3a, p-FoxO3a和Bim蛋白的表达变化。
　　结果：
　　1. MTT法显示，H2O2可以明显降低 H9c2心肌细胞的活力，FGF-2预孵育能够拮抗H2O2诱导的H9c2心肌细胞活力降低，在100μmol/L时效果最明显。故本实验中选择的药物处理浓度：H2O2最适浓度为100μmol/L，FGF-2的最适浓度为10ng/ml。加入PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002后，可以逆转FGF-2对H2O2诱导的H9c2心肌细胞活力降低的抑制作用。
　　2. Hoechst33258和TUNEL染色结果显示：与对照组相比，H2O2组可见大量凋亡细胞，凋亡细胞数明显增多；与H2O2组比较，FGF-2+H2O2组的凋亡细胞数明显降低；而加入抑制剂 LY294002后，FGF-2+H2O2+LY294002组的凋亡细胞数明显升高，与FGF-2+H2O2组相比，凋亡细胞数明显增多。
　　3.流式细胞术结果显示：H2O2组的细胞凋亡率为27.24％，明显高于对照组(P<0.01)；FGF-2预孵育后， FGF-2+H2O2组细胞的凋亡率可降至6.21%(P<0.01)；与FGF-2+H2O2组相比，FGF-2+H2O2+LY294002组细胞的凋亡率升高至17.89%(P<0.05)。
　　4.100μmol/L H2O2作用H9c2心肌细胞后，随着时间的递增，Akt和FoxO3a蛋白的磷酸化水平逐渐降低（P﹤0.05），而Akt和FoxO3a总蛋白表达变化不明显；胞核FoxO3a在H2O2作用后表达开始逐渐增加，胞浆FoxO3a蛋白于H2O2作用后表达明显降低，作用45min后表达降低了39.6%（P<0.05），同时Bim蛋白的表达明显增高，孵育45min时增加了165.2%（P<0.05）。
　　5.与H2O2组相比，FGF-2+H2O2组可以显著增加细胞内FoxO3a和Akt蛋白的磷酸化（P<0.05）；胞核内的FoxO3a蛋白表达明显减少，而胞浆内的FoxO3a表达则显著增加了42.7%（P<0.05）；同时FGF-2+H2O2组细胞Bim蛋白表达与H2O2组相比也明显降低了32.5%(P<0.05)。加入Akt抑制剂LY294002预先处理，FGF-2+H2O2+LY294002组细胞Akt和FoxO3a蛋白的磷酸化水平明显降低；胞核内FoxO3a蛋白表达增加，胞浆内FoxO3a蛋白表达减少，同时细胞内促凋亡蛋白 Bim的表达明显增加了48.6%(P<0.05)，与FGF-2+H2O2组相比，差异具有显著性。
　　结论：
　　FGF-2可拮抗氧化应激引起的H9c2心肌细胞凋亡，其机制与激活PI3K/Akt/FoxO3a信号通路有关。

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