DAXX通过AR/SREBP-2信号通路下调HepG2细胞中胆固醇的合成

摘要

高胆固醇血症是动脉粥样硬化斑块形成和发展的危险因子之一，雄激素受体作为胆固醇合成相关基因最重要的核转录调控因子，被证实很可能通过与死亡结构域相关蛋白相互结合而丧失转录激活功能，但其具体分子机制还有待进一步验证。
　　目的：为了证实在HepG2细胞中DAXX可以与AR相互结合并抑制其转录调控的胆固醇合成相关基因的转录。
　　方法：稳定转染pCDNA3.1(+)/DAXX至体外培养的HepG2细胞中，终浓度为1μmol/L的丙酸睾酮处理DAXX过表达的HepG2细胞24 h，采用siRNA耗干扰竭内源性DAXX，采用免疫共沉淀法检测DAXX与AR的相互结合，应用油红O染色法、酶偶联比色法和高效液相法检测细胞中总胆固醇的含量，Western Blotting和RT-qPCR法检测AR、SREBP-2和HMGCR的表达水平。
　　结果：在HepG2细胞中 DAXX和 AR可以相互结合，但并不影响AR的转录表达；外源性DAXX过表达的HepG2细胞中总胆固醇的含量显著降低，胞内SREBP-2和HMGCR的表达明显被抑制；DAXX能够有效的阻遏丙酸睾酮对胆固醇合成的促进作用，并伴随着SREBP-2和 HMGCR的表达明显下调；干扰内源性的DAXX后，HepG2细胞中SREBP-2和HMGCR的蛋白和mRNA的表达得到显著恢复。
　　结论：DAXX与AR在HepG2细胞中可以相互结合，并且这种作用会下调SREBP-2和HMGCR的转录表达，阻遏胆固醇的生物合成。

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引言

实验材料与试剂

1. 主要实验仪器

2. 主要实验耗材

3. 主要材料与试剂

实验方法

1. 实验主要溶液配制

2. 质粒扩增与提取

3. 细胞培养与稳定转染

4. Western Blot

5. 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

6. 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）

7. 酶偶联比色法

8. 高效液相色谱法

9. 油红O染色

实验结果

1.Western Blot和RT-PCR鉴定稳定转染后DAXX的蛋白表达水平

2. 免疫共沉淀法证实DAXX可以与AR相互结合

3. 稳定转染DAXX后HepG2细胞中胆固醇的含量下降

4. 外源性DAXX过表达不会影响内源性AR的表达

5. 过表达的外源性DAXX显著抑制SREBP-2的转录

6. 高表达的外源性DAXX显著抑制HMGCR的转录

7. DAXX能够阻断TP对HepG2细胞胆固醇合成的激动作用

8. TP对HepG2细胞中AR的蛋白表达没有明显影响

9. DAXX可以阻断TP上调SREBP-2的转录表达

10. DAXX可以阻断TP上调HMGCR的转录表达

11.Western Blot和RT-PCR鉴定瞬时转染siRNA-DAXX后胞内DAXX的表达水平

12.干扰内源性DAXX对HepG2细胞中AR表达影响甚微

13.干扰内源性DAXX后胞内SREBP-2的表达上调

14.干扰内源性DAXX后HMGCR的表达上调

讨论

结论

参考文献

综述

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