葡萄球菌无毒诱变超抗原GST-mTSST-1对小鼠免疫保护性的研究

摘要

金黄色葡萄球菌是引起医院内外感染的重要病原菌，也是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。金黄色葡萄球菌能产生多种超抗原毒素，其中TSST-1是一种分子量为22kD，含194个氨基酸残基的直链多肽的热源性超抗原，是引起奶牛乳房炎的关键致病因子。无毒诱变超抗原GST-mTSST-1(GlutathioneS-transferaseandMutationToxicShockSyndromeToxic1)融合蛋白是利用基因工程定点诱变技术将TSST-1的致病碱基置换，使其失去致病性获得的融合蛋白。 本实验的目的主要是研究应用基因工程技术获得的金黄色葡萄球菌无毒诱变超抗原GST-mTSST-1融合蛋白的免疫活性、理化特性及其诱导小鼠抗S.aureus834株感染的免疫保护效果，确定小鼠最佳免疫剂量，建立检测特异性抗毒素抗体的间接ELISA方法。这将为金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的研究开发奠定科学依据和理论基础。 将DH5α/pGXmTSST基因工程菌用IPTG诱导表达，经超声波粉碎、离心、收集上清再用GS4B胶亲和层析分离纯化金黄色葡萄球菌无毒诱变超抗原GST-mTSST-1融合蛋白。用纯化GST-mTSST-1融合蛋白按常规多点免疫法免疫家兔获取抗血清，经双向免疫琼脂扩散试验测定抗血清效价，鉴定GST-mTSST-1融合蛋白的免疫活性，研究了温度、酸碱度、反复冻融等理化因素对其免疫活性的影响，同时以SDS-PAGE和薄层凝胶扫描分析GST-mTSST-1融合蛋白的表达量和纯度。免疫攻毒保护性试验中，免疫组用不同剂量的纯化金黄色葡萄球菌无毒诱变超抗原GST-mTSST-1融合蛋白抗原加5％氢氧化铝佐剂背部皮下多点免疫昆明系小白鼠，对照组用无菌PBS加佐剂免疫。笫3次免疫后用5×107cfuS.aureus834鼠攻击感染，观察15d记录小鼠的存活率及检测攻毒3d后免疫组小鼠肝、脾、肾脏中的细菌数变化。并分别采集试验小鼠初次免疫后14、28、42、60、90、120d的血清，间接ELISA检测血清中特异性抗体的效价及抗体水平动态变化规律。对ELISA方法各反应条件进行优化，建立检测血清中特异性抗体的间接ELISA方法。 在宿主菌DH5α中表达出可溶性GST-mTSST-1融合蛋白，经SDS-PAGE和薄层凝胶扫描分析表达的融合蛋白占菌体总蛋白的25％，GST-mTSST-1融合蛋白的纯度达到95％，分子量为47KD与理论值一致。纯化后的GST-mTSST-1融合蛋白免疫家兔产生特异性抗体，双向琼扩试验测得抗体效价＞1：32。该特异抗血清可识别天然rTSST-1蛋白中与融合蛋白GST-mTSST-1相对应的抗原组份，证实GST-mTSST-1融合蛋白具有与野生型rTSST-1相同的表面抗原决定簇。不同理化因素对GST-mTSST-1融合蛋白免疫活性的影响表明该蛋白是一种相当稳定的蛋白质，4℃30d、20℃72h、37℃72h蛋白的免疫活性不受影响，反复冻融多次也不影响其免疫活性，可耐受的pH值范围为5～11。对小鼠的免疫保护性试验结果表明：三次免疫后用5×107cfu感染小鼠，观察8d后免疫组Ⅲ(含抗原蛋白20μg)和免疫组Ⅳ(含抗原蛋白100μg)存活率达到80％，而对照组存活率仅达到20％。观察15d后免疫组Ⅲ、Ⅳ保护效果相当，小鼠存活率均达到50％，明显高于对照组。根据实验结果初步确定该融合蛋白对小鼠的免疫剂量为20μg。攻毒3d后测定免疫组小鼠肝、脾脏中细菌数，免疫组较对照组明显减少，差异显著(P＜0.05)。这些实验证明GST-mTSST-1融合蛋白疫苗对预防致死剂量的金黄色葡萄球菌的感染起到明显的保护效果。本实验对ELISA反应条件进行优化，初步建立了检测抗GST-mTSST-1抗体的血清学诊断方法。间接ELISA检测表明免疫组小白鼠的初次免疫后不同时期的血清中产生有大量高滴度的抗TSST-1毒素特异性抗体，对抵御金黄色葡萄球菌感染起到重要作用。 经过提纯所获得的金黄色葡萄球菌GST-mTSST-1融合蛋白是可溶性的，较好地保持了其免疫原性，小鼠免疫实验证明具有良好的体液免疫应答效果。动物实验表明，GST-mTSST-1疫苗可以防治产超抗原毒素的葡萄球菌菌株的感染，这将为进一步开发金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎基因工程亚单位疫苗奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

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前言

第一部分文献综述

一、奶牛乳房炎疫苗的研究现状

1.奶牛乳房炎的危害

2.奶牛乳房炎的发病原因

3.奶牛乳腺免疫学机制

4.奶牛乳房炎的疫苗研究进展

二、金黄色葡萄球菌超抗原毒素与奶牛乳房炎

第二部分实验内容

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 pGXmTSST突变重组质粒的鉴定结果

2.2 GST-mTSST-1融合蛋白的分离、纯化及表达产物的鉴定

2.3纯化后GST-mTSST-1融合蛋白浓度与纯度的测定

2.4 GST-mTSST-1融合蛋白免疫活性及理化因素对其的影响

2.5间接ELISA方法的建立

2.6 GST-mTSST-1融合蛋白对小鼠免疫保护性的研究

3、讨论

3.1融合蛋白的诱导表达和分离提纯

3.2融合蛋白的免疫活性及理化因素对其活性的影响

3.3间接ELISA方法的建立

3.4 GST-mTSST-1融合蛋白疫苗对小鼠的免疫保护作用

结论

参考文献

附录

致谢