rVBMDMP对内皮细胞管结构形成及细胞外基质、黏附分子基因表达的影响

摘要

目的:重组血管基膜衍生多功能肽(rVBMDMP)是通过整合抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤细胞增殖两种治疗策略设计的。我们的前期研究证实:rVBMDMP对某些肿瘤细胞增殖和内皮细胞增殖均具有抑制作用。本文的主要目的是探讨rVBMDMP通过与内皮细胞相互作用发挥抑制血管生成作用的分子机制。
　　方法:体外培养人脐静脉内皮细胞系(HUVE-12)细胞,平皿集落形成法测定rVBMDMP对血清刺激的HUVE-12细胞生长的抑制作用;AO/EB荧光双染法和DNA琼脂糖凝胶电泳检测rVBMDMP诱导血清激活的HUVE-12细胞凋亡;体外基质胶铺垫和小鼠在体基质胶栓内皮管结构形成实验,评估 rVBMDMP对血管生长因子刺激的HUVE-12细胞内皮管结构形成的抑制作用;高通量的细胞外基质与黏附分子cDNA芯片测定rVBMDMP对血清激活的HUVE-12细胞血管生成平衡改变所涉及基因的转录水平表达变化;实时定量PCR验证cDNA芯片检测的结果。
　　结果:平皿集落形成法表明:rVBMDMP有效抑制血清刺激的HUVE-12细胞生长,呈剂量依赖性。AO/EB双染色荧光显微镜下观察发现:rVBMDMP(0.1,1.0,10.0μM)处理血清刺激的HUVE-12细胞48h后,染色质浓缩,细胞核碎裂等典型凋亡形态的细胞明显增加,细胞凋亡率分别为11.8％±5.8%,51.9%±10.6%,75.5%±11.6%,与对照组(0.2%±0.8%)比较,具有高度显著性差异(P<0.05),呈浓度依赖性。DNA琼脂糖凝胶电泳发现:rVBMDMP(1.0μM)处理血清刺激的HUVE-12细胞24h,48h,出现凋亡细胞典型的“梯形”条带。体外基质胶铺垫96孔板内皮管结构形成实验表明:rVBMDMP(1.0,10.0μM)处理组内皮管结构数目分别为4.1±1.3/孔和3.4±0.9/孔,与对照组(36.1±3.9/孔)比较显著减少(P<0.01)。小鼠在体基质胶栓内皮管结构形成实验结果表明:rVBMDMP(1.0,10.0μM)处理组,H.E染色光镜下观察5个视野内皮管结构数目分别为9.0±2.4和8.5±2.1,与对照组(48±6.9)比较显著减少(P<0.01);DAPI染色荧光显微镜下观察5个视野内皮管结构数目分别为8.0±2.1和7.0±2.6,与对照组(37.0±5.2)比较显著减少(P<0.01)。cDNA芯片检测结果显示:与未处理组比较,rVBMDMP(1.0μM)处理组转录水平表达升高超过2倍的基因包括:Collagen4α2,Collagen6α2,Collagen7α1,Collagen15α1和Collagen27α1;转录水平表达降低超过50%的基因包括:IntegrinαV,Integrinβ7,Integrinβ8,Integrinα7,Integrinβ2,MMP12,MMP1,MMP11和MMP7。实时定量PCR检测结果显示:经内参校正后,与未处理组比较rVBMDMP(0.1,1.0和10.0μM)处理组转录水平表达升高的基因有:Collagen7α1;转录水平表达降低的基因包括:integrinαv,integrinβ3,MMP-10和MMP-12。
　　结论:
　　1.rVBMDMP抑制HUVE-12细胞生长和诱导细胞凋亡。
　　2.rVBMDMP抑制体内、外HUVE-12细胞内皮管结构形成。
　　3.rVBMDMP抑制血管生成的可能机制:rVBMDMP通过诱导内皮细胞凋亡和调控内皮细胞的细胞外基质和基质金属酶的表达,改变内皮管结构生成微环境,进而打破血管生成平衡朝向有利于抑制血管生成方向进展。

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中英文缩略词表

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1. 前 言

2.材料与方法

2.1 受试物与试剂

2.2 动物

2.3 仪器设备

2.4 技术路线

2.5 细胞培养

2.6 平皿集落形成法

2.7 AO/EB双染色荧光显微镜观察

2.8 DNA 琼脂糖凝胶电泳

2.9 培养板铺垫基质胶内皮管结构形成实验

2.10 小鼠在体基质胶栓内皮管结构形成实验

2.11 细胞外基质与黏附分子基因芯片检测

2.12 实时定量PCR检测

2.13 统计学处理

3.结 果

3.1 rVBMDMP对HUVE-12细胞锚定依赖性生长的影响

3.2 rVBMDMP对HUVE-12细胞系凋亡细胞形态学的影响

3.3 rVBMDMP对HUVE-12细胞DNA非随机性剪切的影响

3.4 rVBMDMP对HUVE-12细胞体外基质胶内皮管结构形成的影响

3.5 rVBMDMP对HUVE-12细胞小鼠在体基质胶栓内皮管结构形成的影响

3.6 rVBMDMP对HUVE-12细胞的细胞外基质与黏附分子基因表达的影响

3.7 rVBMDMP对HUVE-12细胞Integrin αV, Integrin β3, MMP-10, MMP-12, Collage7α1 mRNA表达的影响

4.讨 论

5.结论

参考文献

综述

攻读硕士学位期间完成、发表论文情况

致谢