肺炎嗜衣原体CPAF重组蛋白致小鼠肺组织炎症及对炎症细胞因子影响的研究

摘要

目的:将本室构建的肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease–like activity factor,CPAF)的181～400aa基因(CPAFm)的重组表达体在大肠杆菌中诱导表达,纯化表达产物并进行鉴定,研究该重组蛋白在 BALB/c小鼠体内引起的肺部炎症改变及对炎症细胞因子TNF-α和IL-6的水平的影响,为进一步探索CPAF在Cpn感染中的致病作用提供实验依据。
　　方法:重组质粒pGEX6p-2/CPAFm,经酶切和测序鉴定后,转化至E.coli BL21中,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物;复性后用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)琼脂糖凝胶FF纯化重组蛋白,A280紫外分光光度法测定纯化蛋白浓度。将纯化的重组蛋白第1d、3d、6d鼻内或尾静脉注射BALB/c小鼠,第7d处死小鼠,HE染色观察肺组织病理形态学改变,常规血细胞计数法计外周血与支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)中白细胞总数,瑞氏染色观察外周血与BALF中白细胞分类计数,ELISA方法检测血浆和BALF中的TNF-α和IL-6的水平。
　　结果:重组目的基因表达菌在IPTG的诱导下,表达了相对分子质量(Mr)约51.3 kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在,经GST琼脂糖凝胶FF纯化得到纯度达95％以上的重组蛋白。重组蛋白能引起BALB/c小鼠肺组织的炎症病理损伤,光镜下见BALB/c小鼠的肺组织出现中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润,对照组与正常组BALB/c小鼠肺组织未见明显病理改变。尾静脉注射实验组的BALB/c小鼠外周血中性粒细胞比例明显高于GST、PBS对照组和正常组(均P﹤0.01),单核细胞比例明显高于GST对照组(P﹤0.05)、PBS对照组(P﹤0.05)和正常组(P﹤0.01);鼻内滴入实验组 BALB/c小鼠 BALF中白细胞总数明显高于 GST对照组(P﹤0.05)、PBS对照组(P﹤0.05)和正常组(P﹤0.01);鼻内滴入实验组外周血中炎症因子IL-6水平显著高于GST、PBS对照组和正常组(均P﹤0.01),TNF-α水平明显高于GST对照组(P﹤0.05)、PBS对照组(P﹤0.01)和正常组(P﹤0.01);尾静脉注射实验组外周血中炎症因子IL-6的水平明显高于GST、PBS对照组与正常组(均 P﹤0.01);鼻内滴入和尾静脉注射实验组 BALF中炎症因子IL-6、TNF-α的水平明显高于GST、PBS对照组与正常组(均P﹤0.01)。
　　结论:
　　1、成功表达纯化得到51.3 kDa的GST-CPAFm重组蛋白和26kDa的GST蛋白;
　　2、GST-CPAFm重组蛋白能引起BALB/c小鼠肺组织的炎症病理损伤;
　　3、GST-CPAFm重组蛋白能引起BALB/c小鼠体内炎症细胞增多和炎症因子TNF-α、IL-6的水平的升高。

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中文摘要

英文摘要

前言

实 验 材 料

1 主要仪器设备及材料

2 主要实验试剂

3 实验动物：

4 其它

实验方法及步骤

1 GST-CPAFm重组蛋白的纯化

2 GST蛋白的制备

3 BALB/c小鼠体内实验研究GST-CPAFm重组蛋白的致病作用

4 统计学处理

实 验 结 果

1 GST-CPAFm重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

2 GST-CPAFm重组蛋白对BALB/c小鼠的致病作用

讨论

结论

参考文献

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致谢