FAKsiRNA通过下调mTERF1、CyclinD1抑制低氧诱导下人肺动脉平滑肌细胞增殖机制的研究

摘要

目的：
　　讨论低氧诱导下，FAK能否由mTERF1、CyclinD1信号通路抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖。
　　方法：
　　将人肺动脉平滑肌细胞进行原代，利用人工设计、化学合成的人FAK、mTERF1的siRNA脂质体经Lipofectamine2000将转入人肺动脉平滑肌细胞中。将细胞分为常氧（37℃，5％CO2，21%O2）NCsiRNA组、FAKsiRNA组、mTERF1siRNA组，低氧（37℃、5%CO2、5%O2、90%N2）NCsiRNA组、FAKsiRNA组、mTERF1siRNA组。用Realtime-PCR检测细胞内FAKmRNA、mTERF1mRNA、CyclinD1mRNA的水平，Western Blot和FAK、CyclinD1、mTERF1蛋白质的表达，免疫荧光检测FAK、CyclinD1蛋白的表达，CCK8法测定细胞增殖能力。
　　结果：
　　与常氧NCsiRNA组比较，常氧FAKsiRNA组FAKmRNA及蛋白质表达明显减少（P<0.05），而mTERF1、CyclinD1mRNA及蛋白表达无明显差异（P>0.05）；与低氧NCsiRNA组比较，低氧FAKsiRNA组FAKmRNA及蛋白质表达明显减少（P<0.05），而mTERF1 mRNA和mTERF1蛋白质、CyclinD1mRNA和CyclinD1蛋白质表达均减少（P<0.05）；
　　与常氧NCsiRNA组比较,转染mTERF1siRNA后，常氧mTERF1siRNA组mTERF1mRNA及蛋白质表达明显减少（P<0.05），而FAK、CyclinD1mRNA及蛋白质表达无明显变化（P>0.05）。与低氧NCsiRNA组比较,转染mTERF1siRNA后，低氧mTERF1siRNA组mTERF1mRNA及蛋白表达明显减少（P<0.05），低氧下CCND1 mRNA和CCND1蛋白表达减少（P<0.05），而FAKmRNA及FAK蛋白质表达改变不明显（P>0.05）。
　　免疫荧光检测显示常氧FAKsiRNA组与常氧 NCsiRNA组相比较，FAK是siRNA荧光表达下降明显（P<0.05），CyclinD1的荧光表达变化不明显（P>0.05）。低氧下，FAKsiRNA组较NCsiRNA组相比，其FAK荧光表达明显下降（P<0.05），CyclinD1的荧光表达也随之降低（P<0.05）。
　　结论：
　　低氧诱导下，沉默FAK可致人肺动脉平滑肌细胞mTERF1、CyclinD1表达减少，且抑制HPASMCs增殖，而沉默mTERF1后CyclinD1表达减少，FAK表达无明显改变。提示FAK是通过mTERF1/cyclinD1通路信号参与低氧状态下人肺动脉平滑肌细胞的增殖。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

主要中英文对照

主要仪器及试剂

目录

前言

课题研究思路

第1章：原代细胞培养及鉴定

1.1培养原代HPASMCs

1.2 人肺动脉平滑细胞的鉴定

第2章 实验方法

2.1实验分组

2.2细胞转染

2.3 Realtime PCR

2.4 Western-blot

2.5 免疫荧光

2.6 细胞增殖检测（CCK8法）

第3章 统计分析

第4章 实验结果

4.1 RT-PCR检测FAK、mTERF1、CyclinD1mRNA的表达

4.2 Western-Blot检测FAK、 mTERF1、CyclinD1蛋白表达

4.3 免疫荧光检测FAK、CyclinD1蛋白表达

4.4 CCK8检测人肺动脉平滑肌细胞增殖

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

附录

综述:FAK在COPD呼吸道平滑肌细胞增殖中作用机制的研究进展

致谢