腺病毒介导TGFβ1基因体外转染对自体Hamstring腱重建兔ACL的生物力学及影像学影响

摘要

【目的】
　　前交叉韧带(Anterior Cruciate Ligament，ACL)是稳定膝关节的重要部分，其损伤在膝关节的运动损伤中很常见。由于ACL断裂后愈合能力较差，目前采用自体肌腱重建ACL已成为主要手段之一，而自体游离多股Hamstring腱是目前生物力学性能最好的自体移植物，且是一种在临床应用较广泛的移植材料。早期愈合是保障重建韧带最终功能及疗效的重要条件，然而临床上传统的Hamstring腱移植也同样可带来一系列问题，如愈合时间过长等。有研究表明细胞转化生长因子β1(transforming growth factorβ,TGFβ1)对皮肤组织有促进愈合作用，但对腱骨愈合过程中的作用的研究则几乎未见报道。本实验使用腺病毒介导TGFβ1基因转染对自体Hamstring腱重建兔ACL，通过对术后腱骨界面大体形态学、影像学及生物力学的研究，探讨腺病毒介导TGFβ1基因转染自体Hamstring腱后对ACL损伤重建的影响。
　　【方法】
　　术前构建携带 TGFβ1基因的重组腺病毒载体 AdTGFβ1（由上海和元生物公司提供），新西兰大白兔48只，体重2.0±0.4 kg，2-3月龄，随机分为A、B、C三组，以实验兔两侧后肢膝关节作为研究对象，自体Hamstring腱作为 ACL重建物。A组自体同侧转染TGFβ1的Hamstring腱重建ACL，即AdTGFβ1转染组(实验组)；B组自体同侧转染了腺病毒空载体AdGFP的Hamstring腱重建ACL，即 AdGFP转染组(空载体对照组)；C组自体同侧 Hamstring腱重建 ACL组，即DMEM处理组(空白对照组)。术中严格无菌操作，术后预防性抗感染治疗。每组4只实验兔分别术后在2周、4周、8周、12周四个时间点处死，观察、记录移植物大体外观，应用三维CT扫描，数字图像工具测量和记录骨隧道关节腔入口内部直径，获得的内口直径与原始骨隧道直径（2.0mm，钻头直径）之差，得到骨隧道扩大的宽度数据；并通过CT骨密度测量软件测量骨隧道腱骨界面新生骨组织骨密度值。生物力学检测仪测量骨-移植物-骨的最大拉伸载荷、刚度等生物力学特性，对实验数据进行统计学分析，分析比较四组不同时间点移植物重建ACL后的影像学及生物力学的特性。
　　【结果】
　　1.解剖学大体形态
　　实验兔生长状况均良好，重建膝关节的功能恢复尚佳，膝关节抽屉试验和lachnman试验均为阴性。所有的实验动物的膝关节周围均未见明显红肿，切口良好，无感染及裂开等现象，在术后第2周后，B组解剖发现有1例发生关节内感染，A组1例股四头肌及关节腔内长满淡黄色鱼肉样肿块组织，其余的关节腔内有少量积液及大量滑膜增生，移植肌腱与周围组织粘黏紧密，其边界区分困难，未出现关节腔红肿及积脓，其内移植物结构完整，呈白色条索致密结构。劈开骨隧道可见：在术后第2周，A组骨隧道入口内部大量疤痕组织长入；在术后第4周时，A组类似软骨样组织出现，且完全覆盖骨隧道内口，这种似软骨样组织在B组、C组第8周部分才出现，第12周，A、B、C三组完全被软骨样组织覆盖。
　　2．影像学CT观察
　　对每组进行方差齐性检验，均方差齐性。每组两两比较，在术后第4、8、12周,A组较 B、C组骨隧道入口内部直径有明显减小，差异有统计学意义（P<0.05）。在第4、8、12周，A组在骨隧道腱骨界面新形成骨组织的骨密度值明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　3.生物力学检测
　　在术后第2周，A、B、C三组肌腱移植物分别出现7例、6例、7例骨隧道中拔出，1例、2例、1例肌腱撕裂的情况，各组显示无显著性差异（P＞0.05）；在术后第4周，A、B、C三组肌腱移植物分别出现6例、6例、7例骨隧道中拔出，2例、2例、1例肌腱撕裂的情况，各组显示无显著性差异（P＞0.05）；术后第8周，A、B、C三组肌腱移植物分别出现1例、6例、6例骨隧道中拔出，7例、2例、2例肌腱撕裂的情况，两组差异有统计学意义（P＜0.05）；术后12 周,A、B、C组三组肌腱移植物分别出现1例、2例、2例骨隧道中拔出，7例、6例、6例肌腱撕裂的情况，各组显示无显著性差异（P＞0.05）。术后第2周，每组最大拉伸载荷无统计学意义（P＞0.05）；在术后第4周、8周、12周 A组的最大载荷较B、C两组明显增高，统计有显著性差异(P＜0.05)，对比之下，在B组及C组无统计学意义（P＞0.05）；随时间的推移，每组的刚度增加，但是组间差异均没有统计学意义（P＞0.05）。
　　【结论】
　　本实验TGFβ1基因重组腺病毒转染兔Hamstring腱重建ACL的生物力学及影像学观察，结果显示腺病毒介导TGF-β1基因转染对实验家兔自体Hamstring腱重建ACL早期恢复腱骨界面的结构及功能有一定作用。

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主要中英文缩略语索引

第１章 绪 论

1.1 引言

第2章 正 文

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物：

2.1.2 主要实验试剂：

2.1.3 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 实验分组设计

2.2.2 构建携带TGFβ1基因的重组腺病毒载体AdTGFβ1和未携带TGFβ1基因的重组腺病毒空载体AdGFP

2.2.3 重组腺病毒载体体外转染Hamstring腱

2.2.4 兔膝ACL重建模型的建立

2.2.5 标本观察

2.2.6 统计分析

2.3 结 果

2.3.1 重组腺病毒载体体外转染Hamstring腱的检测情况

2.3.2 解剖学大体观察

2.3.2 影像学扫描

2.3.3 生物力学特性

2.4 讨 论

2.4.1基因技术在腱-骨愈合中的应用

2.4.2腱-骨的愈合机制

2.4.3 影响腱-骨愈合的因素

2.4.4 TGF-β1对腱骨愈合的促进作用

2.4.5 不足之处及展望

第3章 结 论

参考文献

综述:关节镜下后交叉韧带重建

读研期间发表的文章

致谢