人间充质干细胞内源性抗氧化水平影响干细胞存活的分子机制研究

摘要

目的：
　　本研究旨在探讨人间充质干细胞内源性抗氧化水平影响干细胞存活的分子机制。
　　方法：
　　利用细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/双氧水（H2O2）协同诱导了一个与体内环境相似的体外氧化炎症压力环境。应用依达拉奉作为抗氧化剂和马来酸二乙酯（diethylmaleate，DEM）作为促氧化剂预处理人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）后的不同时间点，测定干细胞存活能力、细胞凋亡和内源性抗氧化水平的动态变化。其中，采用免疫荧光染色法和caspase-3/7活性法测定细胞凋亡的变化；用MTT评估细胞活性；用活性氧（reactive oxygen species，ROS）染色和GSH/GSSH比值显示细胞内抗氧化水平。然后，用定量PCR系统检测细胞抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax-1的mRNA表达水平变化；用蛋白免疫印迹法（Western blot，WB）测定内源性抗氧化酶中超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase-1，SOD1）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和MAPK、PKC通路各蛋白的表达变化；用试剂盒测定Nrf2转录活性，以期对调控干细胞凋亡和内源性抗氧化水平的分子机制进行探究。最后，用PD98059和staurosporine分别阻断MAPK和PKC通路；用基因沉默的方法阻断Nrf2的抑制蛋白质Keap1的表达，进一步验证MAPK-PKC-Nrf2通路在影响干细胞内源性抗氧化水平中的作用。
　　结果：
　　(1)与对照组比较，LPS/H2O2处理组干细胞活性降低(P<0.05)；与 LPS/H2O2组比较，促氧化剂DEM预处理后在所有时间点都进一步降低了干细胞活性(P<0.05)；与 LPS/H2O2组比较，两种不同浓度的依达拉奉处理组（Eda）均提高了LPS/H2O2刺激下干细胞的增殖活性，差异均有统计学意义(P<0.05)，且两组 Eda浓度间比较无统计学差异(P>0.05)；此外，依达拉奉预处理改善了由LPS/H2O2刺激导致的hUCMSCs细胞形态的异常，而DEM则进一步加剧该异常；
　　(2)结果显示与LPS/H2O2处理组比较，依达拉奉预处理组的10μM和20μM浓度组均降低了hUCMSCs细胞凋亡率，DEM预处理组增高了h UCMSCs细胞凋亡率，二者均有统计学意义（P<0.05; P<0.001）；caspa se-3/7的活性变化与细胞凋亡率变化一致；qPCR结果显示，与对照组比较，在处理后12、24、36、48、60、72小时（h）后，LPS/H2O2组的抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表达率低，而促凋亡蛋白Bax1的mRNA表达率增高（P<0.001)；不同浓度的依达拉奉预处理后，可以抵消这种作用；DEM预处理后，进一步降低了Bcl-2和提高了Bax1的水平；
　　(3)从处理后24h开始，与对照组比较，LPS/H2O2组培养基中DCFH-D A（ROS荧光染色剂）信号更明显，依达拉奉预处理组减弱，而DEM预处理组加剧；GSH/GSSG比值变化与ROS表达情况相符：与对照组比较，在处理后12、24、36、48、72h时，LPS/H2O2组均引起胞内GSH/GSSG比率降低，差异均有统计学意义（P<0.001）；这种降低在依达拉奉组（10μM和20μM）被抵消，而在DEM组更低；
　　(4) Western Blot结果显示，与对照组比较，LPS/H2O2处理后的12、24、36、60和72 h，过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶1（SOD1）蛋白的表达显著降低，尤其是SOD1的表达；与LPS/H2O2组比较，依达拉奉预处理组蛋白表达高，DEM预处理组蛋白表达低(P<0.05）；
　　(5)测定MAPK通路结果显示：与对照组比较，LPS/H2O2处理组在大部分时间点表达更高水平的磷酸化的p38MAPK和ERK1/2。依达拉奉预处理组及 DEM预处理组分别可以消除和增强 LPS/H2O2的该效应；用PD98059和PKC抑制剂分别阻断MAPK和PKC通路后，20μM依达拉奉组对细胞活性降低的升高作用被消除；应用基因沉默 Keap1可以增强Nrf2的活性(P<0.001)，并可以部分逆转DEM对细胞活性的影响。
　　结论：
　　（1）抗氧化剂依达拉奉预处理改善了氧化炎症刺激下hUCMSCs的形态学和生存能力；
　　（2）抗氧化剂依达拉奉预处理后通过上调抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的水平和下调促凋亡基因Bax-1 mRNA水平降低hUCMSCs的凋亡率；
　　（3）抗氧化剂依达拉奉预处理后的hUCMSCs，通过修复氧化炎症刺激导致的内源性抗氧化酶活性损伤，提高干细胞内源性抗氧化水平；
　　（4）干细胞部分通过调控自身MAPK-PKC-Nrf2通路的变化调节内源性抗氧化水平。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

主要英文缩略语索引

第1章 绪 论

第2章 材料与方法

2.1 试剂和仪器

2.2 研究对象

2.3 研究方法

2.4 数据分析

第3章 结 果

3.1 各组hUCMSCs的细胞活性和形态学比较

3.2 凋亡率及caspase-3/7活性与凋亡基因Bcl-2 及Bax1

3.3 胞内GSH/GSSG比值及ROS表达水平变化

3.4 内源性抗氧化酶CAT和SOD1的表达

3.5 MAPK,PKC和Nrf2通路变化

第4章 讨 论

第5章 结 论

参考文献

附 录 (综述):干细胞作为肝脏肿瘤治疗手段的机制研究进展

作者攻读学位期间的科研成果

致谢