罗希土碱通过PI3K/mTOR/PPARγ途径降低巨噬细胞LPL表达及脂质蓄积

摘要

[目的]动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）发病机制复杂，已成为我国首位人口死亡原因之一。动脉壁脂质沉积、泡沫细胞形成等，在As的发生发展中起着重要作用。脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是水解血浆中乳糜微粒（chylomicron，CM）、极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL）等脂蛋白中甘油三酯的关键酶，在脂质代谢中发挥着重要作用。动脉壁中巨噬细胞分泌的LPL具有促进巨噬细胞脂质蓄积的作用，导致泡沫细胞的形成及动脉粥样硬化的发生发展。罗希土碱（rohitukine，RH），是一种色原酮类生物碱，具有抗癌、抗炎、免疫调节的等生物活性，最新研究显示，其具有抑制脂肪细胞分化的作用。本研究目的在于探讨罗希土碱对巨噬细胞LPL的表达及细胞内脂质蓄积的影响。
　　[方法]RAW264.7巨噬细胞经不同浓度（0,5,10,20 uM）罗希土碱处24h及20uM罗希土碱处理不同时间（0,12,24,48h）后，Western blot检测LPL蛋白水平，RT-PCR检测LPL mRNA水平，试剂盒检测LPL活性。20uM罗希土碱与50mg/ml LDL共孵育RAW264.7巨噬细胞24h后，酶法定量检测细胞内甘油三酯(triglyceride，TG)及总胆固醇（total cholesterol,TC）水平，油红O染色法检测巨噬细胞脂滴形成情况。20uM罗希土碱处理RAW264.7巨噬细胞24h后，Western blot（WB）检测磷脂酰肌醇-3激酶磷酸化水平（p-PI3K）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白磷酸化水平（p-mTOR）、PPARγ蛋白水平。外源性加入PPARγ激动剂后，检测LPL蛋白水平、LPL mRNA水平及LPL活性。外源性加入mTOR激动剂后，检测LPL、PPARγ蛋白水平、LPL mRNA水平及LPL活性。外源性加入PI3K激动剂后，检测LPL、p-mTOR、PPARγ蛋白水平、LPL mRNA水平及LPL活性。免疫共沉淀检测巨噬细胞低密度脂蛋白受体（LDLR）与LPL结合情况。
　　[结果]罗希土碱呈剂量和时间依赖性下调 RAW264.7巨噬细胞LPL的表达（蛋白及mRNA水平）及活性，进而减少巨噬细胞LPL介导的细胞内脂质蓄积，细胞内脂滴明显减少，TG及TC含量下降。进一步实验显示，罗希土碱可抑制p-PI3K、p-mTOR及PPARγ的表达。外源性分别加入p-PI3K、p-mTOR及PPARγ的激动剂，罗希土碱抑制巨噬细胞LPL表达及活性的作用均被削减。罗希土碱处理后，巨噬细胞LDLR与LPL的结合减少。
　　[结论]罗希土碱通过PI3/mTOR/PPARγ信号途径降低巨噬细胞LPL表达及活性，并减少巨噬细胞上LDLR与LPL的结合，从而减少巨噬细胞LPL介导的细胞内脂质蓄积。

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第1章 绪 论

第2章 实验材料

2.1 主要实验试剂

2.2 主要实验器材与实验仪器

第3章 实验方法

3.1 RAW 264.7巨噬细胞的培养

3.2 Western Blot（蛋白质免疫印迹）

3.3 RT-PCR（real time PCR，实时荧光定量PCR）

3.4 油红O染色

3.5 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation， Co-IP）

第4章 实 验 结 果

4.1 罗希土碱（RH）对巨噬细胞LPL的表达及活性的影响

4.2 罗希土碱（RH）对LPL介导的巨噬细胞脂质蓄积的影响

4.3 罗希土碱对 RAW264.7 巨噬细胞内 p-PI3K、p-mTOR 及PPARγ表达的影响

4.4 PI3K、mTOR及PPARγ分别在罗希土碱下调巨噬细胞LPL生成中的作用

4.5 罗希土碱对巨噬细胞LPL与LDLR的结合的影响

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

文献综述:Lipoprotein lipase: from gene to atherosclerosis

攻读学位期间所获科研成果

致谢

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