α7nAChR在小鼠脓毒症急性肝损伤的作用及GTS-21干预研究

摘要

背景：脓毒症即感染引起的全身炎症反应综合征（ Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）是现代危重病医学研究领域的热点及难点，急性肝损伤是脓毒症重要并发症之一，直接影响其预后。炎症细胞因子风暴是脓毒症急性肝损伤的主要发病机制之一。胆碱能抗炎通路（CAP）是胆碱能神经及其递质调节对抗全身炎症反应的通路，主要通过烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基（α7nicotinic acetylcholine receptors type，α7nAChR）调节炎性因子的产生，对多种炎症性疾病的发生、发展起重要作用，α7nAChR正逐渐成为调节炎症因子产生和胆碱能抗炎效应药理学的靶标，具有“开关”作用。GTS-21为α7nAChR特异性激动剂，在阿尔茨海默氏病和关节炎等许多免疫炎症性疾病中发挥抗炎保护作用。目前α7nAChR在脓毒症急性肝损伤的抗炎机制及GTS-21对脓毒症急性肝损伤保护作用鲜有报道。
　　目的：观察α7nAChR及其下游炎症因子IL-18、IL-1β、HMGB1在LPS诱导的小鼠脓毒症急性肝损伤模型中的动态表达，探索α7nAChR在急性脓毒症肝损伤的发病机制；观察GTS-21对小鼠脓毒症急性肝损伤模型的保护作用，为脓毒症性肝损伤提供新的治疗依据。
　　方法：
　　实验一α7nAChR在LPS诱导的脓毒症急性肝损伤的发病机制研究
　　60只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为正常对照组(n=10）；急性肝损伤模型组(LPS30mg/kg，n=50），急性肝损伤模型组又分为模型组1h、3h、6h、12h、24h五个亚组，适应性喂养1周，采用LPS30mg/kg腹腔注射造模，造模后1h、3h、6h、12h、24h各点处死存活小鼠；正常对照组腹腔注射等体积LPS助溶剂（生理盐水），1小时后处死小鼠。每组选取8个样本，检测正常对照组及小鼠肝脏 HE染色的病理变化、血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平，采用酶联免疫ELISA法检测肝脏组织IL-18、IL-1β、HMGB1水平，采用Real-Time PCR检测肝组织α7nAChR表达水平。
　　实验二 GTS-21靶向干预对 LPS诱导的小鼠脓毒症急性肝损伤的保护作用
　　（1）40只雄性 C57BL/6小鼠按随机数字表法分为正常对照组(n=10）；空白对照组(GTS-213mg/kg，n=10）；模型组(LPS30mg/kg， n=10）；GTS-21干预组(LPS30mg/kg+GTS-213mg/kg，n=10），适应性喂养1周，模型组采用LPS30mg/kg腹腔注射造模，正常对照组予等体积LPS助溶剂（生理盐水）腹腔注射，空白对照组采用GTS-213mg/kg腹腔注射，不注射LPS，干预组于造模前（LPS30mg/kg）30min腹腔注射GTS-213mg/kg。于造模后6h处死各组小鼠（各组均无小鼠死亡），每组选取8个样本，检测各组小鼠肝脏HE染色的病理变化情况、血清ALT、AST水平，肝脏组织 IL-18、IL-1β、HMGB含量及α7nAChR表达水平。
　　（2）30只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为模型组（n=15）、干预组（n=15），适应性喂养1周，模型组采用LPS30mg/kg腹腔注射造模，干预组于造模前（LPS30mg/kg）30min腹腔注射 GTS-213mg/kg。观察48h内各组小鼠的症状和生存情况，清点各时点小鼠的存活数，绘制生存曲线，进行生存分析。
　　结果：
　　实验一α7nAChR在LPS诱导的脓毒症急性肝损伤的发病机制研究
　　(1)与正常对照组比较，光镜下模型组各亚组小鼠肝组织均有不同程度病变，其中模型组6h病变最显著，正常对照组肝脏病理指数为0，模型组6h为0.57，与其他亚组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。（2）与正常对照组比较，模型组中各亚组小鼠血清AST、ALT水平均增高，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中模型组6小时AST(378.37±59.27 vs170.00±55.88P=0.011）,ALT(132.58±45.53 vs56.93±10.92P=0.002）升高最显著，相比于模型组其他亚组，差异均有统计学意义(P<0.05)。（3）与正常对照组比较，模型组中各亚组肝组织IL-18、HMGB1、IL-1β水平均增高，差异均有统计学意义(P<0．05)，其中IL-18（393.83±60.18 vs86.87±10.12）、IL-1β（3988.92±253.25 vs1148.15±66.00）在造模后6h升高最显著，与其他模型组亚组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，而HMGB1（21.30±2.11 vs4.99±1.07）则在造模后12h升高最显著，相较于模型组其他亚组，差异有统计学意义(P<0.05)。（4）与正常对照组比较，随着造模时间的增加，模型组各亚组小鼠肝组织α7nAChR表达呈逐渐降低趋势，差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　实验二 GTS-21靶向干预对LPS诱导的小鼠脓毒症急性肝损伤的保护作用
　　（1）与正常对照组比较，光镜下模型组肝组织可见大量炎症细胞浸润及细胞坏死，病理改变显著；与模型组比较，干预组肝组织病理变化明显改善，正常对照组肝脏病理指数为0，干预组较模型组为（0.21±0.16 vs0.57±0.00），差异有统计学意义(P<0.05)。（2）与正常对照组比较，模型组AST(378.37±59.27 vs170.00±55.88 P=0.011）,ALT(132.58±45.53vs56.93±10.92P=0.002）明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，干预组小鼠血清AST(222.51±72.17 VS378.37±59.27P=0.011)、ALT（61.12±19.25 VS132.58±45.53P=0.011)明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。（3）与正常对照组比较，模型组肝组织IL-18、HMGB1、IL-1β水平均升高，IL-18（393.83±60.18 vs86.87±10.12）、HMGB1（13.22±1.88 vs4.99±1.07）、IL-1β（3988.92±253.25 vs1148.15±66.00），差异均有统计学意义(P<0.05)，与模型组相比，干预组肝组织IL-18（132.05±22.23 VS393.83±60.18P=0.02)、IL-1β(1625.08±120.38 VS3988.92±253.25P=0.011)、HMGB1(7.73±1.75 VS21.30±2.11P=0.022)水平明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。（4）与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织α7nAChR表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而干预组肝组织α7nAChR表达较模型组明显升高（2.11±0.26 VS1.11±0.11），差异有显著统计学意义(P<0.01)。（5）模型组小鼠生存率为53.3％， 干预组为93.3%，干预后小鼠生存率明显改善，差异有统计学意义(P=0.01)。
　　结论：（1）α7nAChR在小鼠脓毒症急性肝损伤模型发病机制中起重要作用，主要与调节下游炎症因子产生有关。（2）GTS-21对小鼠脓毒症急性肝损伤模型具有保护作用，主要与调节α7nAChR表达有关。

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主要英文缩略词索引

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第一章 绪论

1.1 国内外研究现状

1.2 研究内容及意义

第二章 材料与方法

2.1.实验材料

2.2实验方法

2.3统计学处理

第三章 结 果

实验一

实验二

第四章 讨 论

4.1 脓毒症急性肝损伤实验模型

4.2 炎症反应在脓毒症急性肝损伤的动态变化及影响

4.3 α7nAChR在脓毒症肝损伤的动态表达及机制作用

4.4 GTS-21在脓毒症急性肝损伤的保护作用及抗炎机制

第五章 结 论

参考文献

综述:胆碱能抗炎通路与脓毒症发病机制的研究进展

硕士期间主持/参与的科研项目

硕士期间发表文章

学术交流

致谢