长链非编码RNAlnc-RI调控细胞有丝分裂的机制研究

摘要

目的:lnc-RI是我们实验室发现的一个新的辐射诱导表达的长链非编码 RNA，目前尚没有关于该基因功能的研究报道。本研究目的是在前期研究提示 lnc-RI具有调控细胞有丝分裂和纺锤体形成的功能的基础上，进一步寻找lnc-RI的靶基因，并试图从中发现参与或介导lnc-RI对细胞有丝分裂过程调节作用的靶基因，及阐述其作用机制。
　　方法:1.通过RNA干扰技术，建立敲低HeLa细胞中lnc-RI基因表达的细胞模型，采用基因芯片技术从lnc-RI基因下调表达的细胞中筛选差异表达基因；通过生物信息学分析寻找lnc-RI的调控靶基因，并从中鉴定细胞周期（有丝分裂期）相关基因。采用PCR和Western blot方法对筛选到的差异靶基因进行验证。
　　2.用慢病毒包装系统(LV-shRNA-NC、LV-shRNA-lnc-RI)感染HeLa细胞，三天后，在慢病毒已稳定整合表达（lnc-RI下调）的细胞中转染pCMV-myc-PLK1质粒，采用流式细胞术分析细胞周期和有丝分裂指数。
　　3.选用荧光素酶双报告基因表达实验和RT-PCR分析lnc-RI表达下调对Plk1基因启动子活性和mRNA稳定性的影响。
　　4.通过荧光素酶报告基因结合突变实验验证 miRNA-210与lnc-RI的结合序列。
　　结果:1.本研究测试了lnc-RI特异的两条有效RNA干涉序列，基因芯片数据分析发现两条干涉序列导致1.5倍以上变化的共同差异表达基因有149个，其中116个基因表达上调，33个基因表达下调。
　　2.差异基因主要涉及的生物学通路有：MAPK信号通路、细胞骨架形成、癌症通路、钙信号通路、蛋白酶体途径、DNA损伤修复、细胞有丝分裂、纺锤体形成等。
　　3.生物信息分析揭示BCL2、PLK1、KDM2A、THBS1、MAP3K1、FGFR3等分子处于相互作用网络的中心位置，推测它们可能在lnc-RI下调所诱导的生物学效应中具有较重要的作用。
　　4.发现下调lnc-RI表达显著抑制细胞有丝分裂调控分子PLK1的mRNA和蛋白表达，与基因芯片数据具有很好的一致性。并且发现在lnc-RI敲低细胞中回转表达外源 Plk1基因，可以解除 lnc-RI表达下调引起的有丝分裂期阻滞。
　　5.下调lnc-RI表达对Plk1启动子活性没有影响，但促进Plk1基因的 mRNA的降解；并且 miRNA-210可以直接结合 lnc-RI的743-764bp位序列，促使PLK1下调同时也抑制lnc-RI的表达。
　　结论:1. lnc-RI调控的靶基因分布于多个生物学通路中，包括：DNA损伤修复、细胞周期调控（细胞有丝分裂，纺锤体形成等）、染色体修饰、氧化应激反应、p53通路、细胞凋亡、蛋白质代谢、转录调节等。
　　2.对 lnc-RI下游靶基因相互作用网络中心节点基因进行了详细的分子功能分析发现，重要的有丝分裂调控分子 PLK1可能是参与lnc-RI调控有丝分裂阻滞的关键靶分子。
　　3.研究证实了基因芯片的数据的可靠性，明确了PLK1是lnc-RI 下调引起有丝分裂阻滞的下游靶分子。但lnc-RI不是通过影响PLK1的转录来对其进行调控的，而是通过影响其mRNA降解来调控PLK1的。并且lnc-RI是通过竞争性结合miRNA-210来调控PLK1表达，进而调控细胞有丝分裂进程的。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

第一部分 lnc-RI下游靶基因的筛选和功能分析

1 材料与方法

2 结果

3.讨论

第二部分 lnc-RI调控PLK1表达及机制研究

1 材料与方法

2 结果

3讨论

结论

参考文献

文献综述: 基因芯片技术及其在生命科学研究中的应用进展

主要英文缩略语索引(按字母顺序排序)

作者攻读学位期间的科研成果

致谢