MiR-186靶向抑制胱硫醚-γ-裂解酶对THP-1巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响

摘要

目的：富含脂质的巨噬细胞蓄积是动脉粥样硬化损伤的主要特征之一，主要发生在主动脉分支处。有研究表明miR-186在心肌损伤和心肌梗死中高表达，同时在动脉粥样硬化性疾病中起重要作用，但其背后作用机制尚不明确。值得注意的是，在本课题组之前的研究中，我们发现H2S可以通过降低巨噬细胞的脂质蓄积及促炎因子的分泌改善动脉粥样硬化。胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）是心血管系统中H2S生成的关键限速酶。在本研究前期预实验中发现miR-186能与CSE mRNA3’UTR端结合。本课题的研究旨在探讨miR-186是否通过靶向作用于CSE继而促进THP-1巨噬细胞的脂质蓄积和促炎因子的分泌，并对其相关作用机制进行了初步探讨。
　　方法：首先用生物信息学软件分析miR-186与人源CSE mRNA3’UTR序列基本情况；接着利用双荧光素酶报告基因分析检测了miR-186与人源CSE mRNA3’UTR的结合情况，同时证实了miR-186确实能与人源CSE mRNA3’UTR结合；此外，我们利用脂质体2000分别将scrambledmiR-186、miR-186 mimic和miR-186 inhibitor转染到THP-1泡沫源性巨噬细胞，用高效液相色谱法（HPLC）分别检测了细胞内胆固醇酯（CE）、游离胆固醇（FC）及总胆固醇（TC）水平；Elisa检测细胞上清液中炎症因子的含量变化；用Western blot和RT-PCR分别检测细胞内CSE和LPL蛋白及mRNA的表达；采用亚甲基蓝法结合分光光度仪检测内源性H2S的含量。利用CSEsiRNA干扰CSE的表达，使其表达降低。
　　结果：通过生物信息学相关分析和双荧光素报告酶基因检测，发现miR-186恰好具有靶向调控CSE的生物信息学基础，能直接抑制CSE蛋白和mRNA的表达。同时，我们分别利用高效液相色谱（HPLC）法和ELISA检测发现miR-186能促进THP-1巨噬细胞的脂质蓄积和促炎因子的分泌。有研究表明，上调CSE/H2S信号通路有显著的抗动脉粥样硬化作用，基于此，推测miR-186可能是通过抑制CSE促进THP-1巨噬细胞的脂质蓄积和促炎因子的分泌。由于CSE是心血管系统中内源性H2S生成的关键限速酶，CSE mRNA和蛋白的表达水平的降低直接导致巨噬细胞内H2S的生成量减少。而在本研究中内源性H2S含量的变化，影响了THP-1巨噬细胞内LPL mRNA和蛋白的表达，二者的变化呈负相关。而且巨噬细胞源性LPL是巨噬细胞泡沫化的一个重要因素，LPL活性及表达的增强促进了巨噬细胞内的脂质蓄积和炎症因子分泌。
　　结论：miR-186能够抑制CSEmRNA和蛋白的表达，降低内源性H2S的含量，使巨噬细胞内LPL表达增强，促进巨噬细胞的脂质蓄积和促炎因子的分泌。

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主要英文缩略语索引

第1章 绪 论

第2章 实验材料

2.1 预测软件

2.2 主要实验试剂

2.3 试剂配制

2.4 主要实验器材

第3章 实验方法

3.1 细胞培养

3.2 生物信息学分析

3.3 miR-186mimic/inhibitor的转染和荧光素酶活性检测

3.4 蛋白质印迹

3.5 实时定量PCR

3.6 高效液相色谱

3.7 H2S含量的测定

3.8 ELISA测定炎症因子

3.9 CSEsiRNA的转染

3.10 LPL活性测定

3.11 统计分析

第4章 实验结果

4.1生物信息学预测结果

4.2 miR-186与THP-1细胞CSE的靶向结合作用

4.3 miR-186对THP-1巨噬细胞中CSE表达及内源性H2S的影响

4.4 miR-186对经oxLDL处理的THP-1巨噬细胞内脂质的影响

4.5 miR-186对经oxLDL处理的THP-1巨噬细胞促炎因子分泌的影响

4.6 CSE在miR-186促进THP-1巨噬细胞脂质蓄积及促炎因子分泌中的作用

第5章 讨 论

第6章 结 论

参考文献

文 献 综 述: PPARs在长链脂肪酸调控能量代谢中的作用

攻读学位期间所获科研成果

致谢