梅毒螺旋体鞘蛋白Tp0664经TLR2途径诱导THP-1细胞表达IL-6

摘要

目的：构建梅毒螺旋体（Tp）重组鞘蛋白Tp0664的原核表达载体，在纯化并鉴定表达产物后去除其中的内毒素，初步探讨其诱导THP-1细胞产生促炎细胞因子IL-6的能力。此外，通过研究TLR2负显性质粒、TLR4与TLR5干扰RNA、TLR6负显性质粒、MyD88负显性质粒、ERK特异性抑制剂PD98059、JNK特异性抑制剂SP600125、p38特异性抑制剂SB203580和NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082对Tp0664诱导THP-1细胞产生IL-6的影响，探讨其诱导THP-1细胞产生IL-6是否与TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、MyD88、ERK1/2、JNK、p38和NF-κB介导的信号转导途经有关。
　　方法：从GenBank获取tp0664基因的完整序列，然后设计高特异性引物。提取Tp Nichols标准株DNA，以其为模板，PCR技术扩增tp0664全长基因；构建pET28a-Tp0664原核表达载体，经菌液PCR以及测序鉴定后，将其转化至E. coli BL21(DE3)表达宿主菌中，IPTG诱导重组蛋白Tp0664的表达。采用SDS-PAGE和Western bloting对表达产物进行分析、鉴定；使用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度；多黏菌素B去除Tp0664中的内毒素后使用鲎试剂测定Tp0664中内毒素含量；Tp0664刺激THP-1细胞， RT-PCR检测IL-6 mRNA转录水平，ELISA双抗体夹心法检测IL-6表达水平，Western bloting检测相关信号分子磷酸化水平。TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和MyD88负显性质粒或干扰RNA转染至THP-1细胞后，Tp0664刺激THP-1细胞，RT-PCR、ELISA和Western bloting分别检测IL-6 mRNA转录水平、IL-6表达水平和相关信号分子的磷酸化水平。ERK1/2特异性抑制剂 PD98059、JNK特异性抑制剂SP600125、p38特异性抑制剂 SB203580和 NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082分别预处理THP-1细胞30min后，Tp0664刺激THP-1细胞，RT-PCR、ELISA和Western bloting分别检测IL-6 mRNA转录水平、IL-6表达水平和相关信号分子的磷酸化水平。
　　结果：成功构建pET28a-Tp0664重组质粒，经菌液PCR和测序鉴定后证实插入片段为tp0664基因序列；E. coli BL21表达菌在IPTG诱导后表达相对分子量Mr约为34kDa的目的蛋白。经分析，Tp0664为可溶性蛋白。Ni-NTA亲和层析纯化后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE证实蛋白纯度＞95％，Mr与目的蛋白大小相符。Western bloting鉴定表明纯化的重组蛋白即为目的蛋白。多黏菌素B处理 Tp0664后稀释，鲎试剂测定该重组蛋白所含内毒素为0.036EU/mL；不同浓度Tp0664（0.5μg/mL~10μg/mL）刺激THP-1细胞均能引起 IL-6 mRNA转录水平升高以及 IL-6表达水平升高，但1.0μg/mL刺激THP-1细胞24h时IL-6 mRNA转录水平最高，1.0μg/mL刺激THP-1细胞48h时IL-6表达水平最高。THP-1细胞转染TLR2和MyD88负显性质粒后，IL-6 mRNA转录水平和IL-6表达水平明显受抑。ERK1/2特异性抑制剂PD98059、p38特异性抑制剂SB203580和NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082预处理THP-1细胞30min后，再以Tp0664刺激THP-1细胞，IL-6 mRNA转录水平和IL-6表达水平明显受抑，处理组与对照组比较有明显差异。但是， JNK特异性抑制剂 SP600125在预处理 THP-1细胞30min后抑制Tp0664诱导IL-6 mRNA转录以及IL-6表达的效果不佳，差异无统计学意义。
　　结论：
　　（1）Tp重组鞘蛋白 Tp0664可诱导THP-1细胞表达促炎细胞因子IL-6；
　　（2）TLR2、MyD88、ERK1/2、p38和NF-κB参与重组蛋白Tp0664诱导THP-1细胞表达促炎细胞因子IL-6。

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主要缩略语英文索引

第一章 前言

第二章 实验材料

1. 实验动物

2. 菌株和质粒

3. 主要仪器设备

4. 主要实验试剂及试剂盒

第三章 实验方法

1. Tp DNA提取

2. tp0664全基因序列扩增

3. pET28a-Tp0664原核表达载体的构建与鉴定

4. Tp0664重组蛋白的表达与鉴定

5. 重组蛋白Tp0664的Western bloting鉴定

6. 重组蛋白Tp0664纯化以及浓度测定

7. 重组蛋白Tp0664免疫新西兰兔后检测抗体效价

8. 重组蛋白Tp0664去除内毒素后的内毒素浓度测定

9. THP-1细胞培养

10. 重组蛋白Tp0664刺激实验

11. Western bloting检测蛋白表达以及激酶磷酸化水平

12. 瞬时转染与RNA干扰

13. DN-TLR2、DN-TLR6和DN-MyD88扩增与转染

14. RT-PCR检测IL-6 mRNA转录

15. ELISA检测IL-6分泌

16. MAPKs和NF-κB抑制剂下调Tp0664诱导THP-1细胞分泌IL-6

17. 免疫荧光检测p65核转位

18. 统计学分析

第四章 实验结果

1. tp0664基因的PCR扩增

2. pET28a-Tp0664原核表达载体的PCR鉴定

3. pET28a-Tp0664重组质粒的测序鉴定

4. pET28a-Tp0664重组质粒诱导表达条件的优化

5. His-tagged Tp0664蛋白的表达与纯化

6. 重组蛋白Tp0664的Western bloting鉴定

7. 重组蛋白Tp0664浓度测定

8. ELISA检测重组蛋白Tp0664免疫后的兔血清抗体效价

9. 重组蛋白Tp0664内毒素的测定

10. 重组蛋白Tp0664刺激THP-1细胞后mRNA完整性鉴定

11. 重组蛋白Tp0664诱导THP-1细胞表达IL-6 mRNA

12. 重组蛋白Tp0664诱导THP-1细胞分泌IL-6

13. Tp0664诱导THP-1细胞活化ERK1/2、p38和NF-κB

14. ERK1/2、p38 和 NF-κB 特异性抑制剂抑制 Tp0664 诱导THP-1细胞分泌IL-6

15. ERK1/2、p38和NF-κB特异性抑制剂抑制Tp0664诱导其磷酸化

16. DN-MyD88阻断Tp0664诱导THP-1细胞分泌IL-6

17. DN-TLR2阻断Tp0664诱导THP-1细胞分泌IL-6

18. DN-TLR2抑制THP-1细胞ERK1/2、p38和NF-κB磷酸化

19. NF-κB抑制剂BAY11-7082抑制THP-1细胞p65核转位

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

文献综述 :梅毒螺旋体遗传物质和致病机制的研究进展

硕士期间科研成果

资助项目

致谢