基于功能嵌合适体和外切酶Ⅲ的汞和金属硫蛋白生物传感研究

摘要

汞(mercury)是广泛存在于自然界的一种重金属污染物，在较低的浓度下，也能够对生态环境和人类健康造成很大的威胁，是全球最引人关注的环境污染物之一。金属硫蛋白(metallothioneins, MTs)是一类富含半胱氨酸的低分子量、热稳定性和可诱导型金属结合蛋白，具有重金属解毒、自由基清除、抗辐射及抑制肿瘤等重要的生物学功能。此外，金属硫蛋白的表达是评价环境中重金属污染的一种关键性的生物标志物。因此，建立简便、快速、灵敏、实用的检测汞离子和金属硫蛋白的新方法对环境污染物监测、职业健康风险评价以及金属硫蛋白生物学功能的研究都具有重要意义。
　　第一章前言部分介绍了汞和金属硫蛋白的研究意义及检测方法，并概述了G-四聚体(G–quadruplex) DNAzyme和核酸外切酶Ⅲ在生物传感领域的应用。
　　第二章建立了基于功能化的嵌合适体构象改变双通道比色法检测汞和金属硫蛋白。实验设计的功能嵌合适体包含一段富T及富G序列,在没有汞离子(Hg2+)存在的情况下,可以形成完整的G–四聚体,结合氯化高铁血红素(hemin)后具有过氧化物酶活性,能催化过氧化氢(H2O2)氧化2,2’–联氮–二–(3–乙基苯并噻唑啉–6–磺酸)二铵盐(ABTS)发生显色反应。加入Hg2+后,Hg2+特异性的识别富T序列形成t–hg2+–t结构,导致嵌合适体发生构象改变,不能形成g–quadruplex,催化活性降低,继而引起体系颜色和吸光度的改变。加入mts后,mts通过巯基结合hg2+生成mts–hg2+复合物,促使嵌合适体向g–quadruplex转变,体系的颜色和吸光度也随之改变。基于g–quadruplex和t–hg2+–t结构的构象转换,我们建立了双通道比色法测定汞和金属硫蛋白的新方法。在优化的实验条件下,hg2+的浓度为8.84×10-9–1.0×10-6mol·l-1时,体系的?a与hg2+浓度有良好的线性关系。线性回归方程为?a=0.0428+0.178c(×10-7mol·l-1),r=0.9963。mts的浓度为7.22×10-9–4.62×10-7mol·l-1时,体系的?a与mts浓度有良好的线性关系。回归方程为?a=0.0333+0.185c(×10-7mol·l-1),r=0.9995。汞和mts的检出限分别为2.65×10-9mol·l-1和2.34×10–9mol·l-1。本文设计的方法简单、灵敏度高、选择性强、成本低,已成功应用于尿样中痕量mts的测定。
　　第三章基于核酸外切酶Ⅲ荧光放大技术建立了一种简单、快速地检测汞离子的新方法。课题设计了一条分子信标,5’端标记有6–羧基荧光素(6–carboxylfluorescein,6–fam)荧光基团,3’端游离出的连续3个g碱基可以猝灭5’端的荧光。当存在汞离子时,分子信标与适体链通过t–hg2+–t配位结合,形成3’端齐平的双链dna(dsdna),可以被核酸外切酶iii识别并进行剪切,释放出荧光基团、汞离子和适体链,而被释放出的汞离子及适体链继续和新的分子信标杂交,“杂交–酶切–释放”的过程不断循环,体系的荧光信号显著增强。在优化的实验条件下,汞离子的浓度为1.0×10-9–4.68×10-8 mol·L-1时,体系的?F与汞离子浓度有良好的线性关系。回归方程为ΔF=–82.1+30.4c(×10-9 mol·L-1),r=0.9989,检出限为3.0×10-10 mol·L-1。该方法已经成功应用于水样品中汞离子浓度的检测,回收率为95.8％–106.9%。

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主要缩写符号与对照

第一章 前 言

1.1 研究意义

1.2 汞和金属硫蛋白的检测方法

1.3 G–quadruplex DNAzyme在生物传感领域的应用

1.4 核酸外切酶III信号放大技术在生物传感领域的应用

1.5 本研究的主要内容

第二章 基于功能嵌合适体双通道比色法检测汞和金属硫蛋白

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 实验共存物质对Hg2+和MTs检测的影响

2.5 标准曲线、检出限及精密度

2.6 样品的分析

2.7 结论

第三章 基于外切酶III辅助信号放大荧光法检测汞

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 样品分析

3.5 结论

参考文献

综述: 基于T–Hg2+–T结构的汞生物传感器研究进展

作者攻读学位期间的科研成果

致谢