汞特异性生物传感器的构建及表面展示金属硫蛋白对汞和镉的吸附

摘要

本研究利用组成型启动子ptet，汞诱导型启动子pmerR，表面展示冰晶核蛋白INP，镉的金属硫蛋白Mt3α，汞的金属结合蛋白MerR，以及作为荧光标记的加强型绿色荧光蛋白EGFP等，经基因工程技术构建融合基因ptet-inp-mt3α-egfp，ptet-inp-merR-egfp，及pmerR-inp-merR-egfp。
　　 宿主细菌为恶臭假单胞菌X4，腐生型革兰氏阴性细菌，对环境的抗逆性很强，能够耐受并吸附汞和镉等重金属。将构建的融合基因插入到X4基因组，获得了3株工程菌株:
　　 X4-1: X4/(ptet-INP-Mt3α-EGFP)（组成型表达，吸附镉）
　　 X4-2: X4/(ptet-INP-MerR-EGFP)（组成型表达，吸附汞）
　　 X4-3:X4/(pmerR-INP-MerR-EGFP)（诱导性表达，汞检测和吸附）
　　 通过在荧光显微镜下观察菌体验证了融合基因的正常表达，Western Blotting技术验证了融合蛋白展示到细胞膜表面。
　　 随着细菌X4-1、X4-2的生长，融合蛋白的表达量也相应的增加，说明组成型启动子ptet稳定性好。X4-3在2μM汞离子条件下诱导2h就能达到较高的荧光值，而且pmerR启动子对汞离子的检测范围为10nM～100μM。启动子对汞离子的特异性非常强，在Cu2+、Cd2+、Zn2+浓度为1～10μM时有极其微弱的诱导荧光。
　　 工程菌株对重金属抗性和吸附能力的分析显示，菌株X4-1相比于原始X4对镉离子耐受性明显提高，对镉离子的最大吸附量为11.2mg/g，是原始X4镉吸附能力的3.1倍。菌株X4-2、X4-3相比于X4对汞离子耐受性明显提高，X4-2菌株对汞离子的最大吸附量为8.29mg/g，X4-3菌株的最大吸附量为7.75mg/g，分别是原始X4汞吸附能力的2.3倍，2.2倍。
　　 通过基因工程技术改造工程菌X4能够明显提高它对重金属的吸附性能，可应用到对土壤、水体进行原位检测和修复。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

1 前言

1．1 重金属污染现状

1．1．1 重金属对生物体的毒性

1．1．2 中国重金属污染现状

1．2 土壤环境中重金属污染的治理方法

1．2．1 土壤重金属污染的修复方法

1．2．2 重金属污染的检测

1．3 细胞表面展示技术在重金属污染治理中的应用

1．3．1 金属硫蛋白的研究进展

1．3．2 细胞表面展示金属硫蛋白吸附重金属

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株和质粒

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 重组质粒的构建

2．2．2 基因克隆操作方法

2．2．3 工程菌株性能的测定

3 结果与分析

3．1 启动子ptet和pmerR特异性和灵敏性的检测

3．2 PCR验证工程菌的插入融合基因

3．2 工程菌株在荧光显微镜下的发光图

3．4 细胞分级分离以及Western Blotting结果

3．5 工程菌生长曲线和荧光曲线的测定

3．6 工程菌X4-3在汞离子条件下最佳诱导时间的确定

3．7 工程菌X4-3在不同浓度汞离子诱导下的相对荧光值

3．8 工程菌对汞离子和镉离子的耐受性

3．9 工程菌对镉和汞的吸附能力

3．10 工程菌在土壤中的定殖能力

4 讨论

参考文献

致谢