GKN2对CD44（+）SGC7901胃癌细胞的抑制作用研究

摘要

目的:研究胃动蛋白2(GKN2)对CD44(+)SGC7901胃癌干细胞(GCSCs)增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡的影响，初步阐明GKN2对GCSCs的抑制作用，为临床设计有效治疗胃癌的策略提供理论依据。
　　方法:
　　1、构建GKN2载体质粒，瞬时转染人胃癌MKN28细胞，荧光显微镜下观察转染效率，Western Blot验证GKN2转染是否成功；从GKN2转染的细胞培养上清液中收集分泌蛋白，超滤法进行纯化和浓缩；采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，考马斯亮蓝染色、Western Blot验证分泌蛋白为GKN2。
　　2、采用免疫磁珠细胞分选（MACS）技术从人胃癌 SGC7901细胞中分选出 CD44(+)GCSCs，免疫荧光检测分选效率。
　　3、运用 CCK-8、肿瘤克隆球形成、Transwell迁移、Transwell侵袭和流式细胞术分析GKN2对GCSCs增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡的影响；CCK-8实验比较GKN2与5-Fu和VP-16对GCSCs的增殖抑制作用。
　　结果:
　　1、转染实验结果显示， GKN2载体质粒转染效率约为91％。Western Blot实验结果显示，与未转染组（0.014±0.003）和空载体组（0.015±0.004）相比，MKN28细胞中GKN2转染组（1.037±0.030） GKN2蛋白的相对表达量明显增加，提示GKN2转染成功。
　　2、收集分泌蛋白经纯化浓缩后测定蛋白浓度，结果显示，转染GKN2组的蛋白总浓度约为27.4g/L，未转染GKN2组的蛋白总浓度约为22.4g/L。考马斯亮蓝染色结果显示，与未转染组相比较， Ad-GFP-GKN2转染MKN28细胞后主要分泌一种蛋白至培养液，根据条带的位置可以初步判断该蛋白为GKN2分泌蛋白，然后Western Blot实验验证了该蛋白即为GKN2蛋白。
　　3、免疫荧光结果：细胞胞膜呈现绿色荧光，未分选的SGC7901细胞CD44阳性率仅有9%，分选后的CD44(+)SGC7901细胞CD44阳性表达率为97%，证明从SGC7901细胞中成功分选GCSCs。
　　4、CCK-8实验结果显示，10、20、40、80、160、320 mg/L的GKN2蛋白作用GCSCs24h、48h和72h后均能抑制其增殖，且其抑制作用呈现浓度-时间依赖关系；GKN2抑制GCSCs的IC50值约为30mg/L；GKN2抑制作用强于5-Fu与VP-16。
　　5、肿瘤克隆球形成实验表明， GKN2处理组克隆球形成数目（15.1±0.45）明显少于未处理组（38.6±0.62）和不含 GKN2的对照组（38.0±0.44），且克隆球直径较其小、透光度较其高，提示GKN2对GCSCs克隆球的形成具有显著抑制作用。
　　6、Transwell迁移实验发现，GKN2处理组（69±3）迁移细胞数目明显低于未处理组（174±6）和不含 GKN2的对照组（173±7）；Transwell侵袭实验显示，GKN2处理组（36±6）穿过基质胶转移至下室的细胞数目明显低于未处理组（94±12）和不含 GKN2的对照组（93±9）。以上结果表明GKN2可明显抑制GCSCs的迁移侵袭能力。
　　7、流式细胞术检测结果显示, GKN2处理组CD44（+）SGC7901细胞周期与未处理组和不含GKN2的对照组相比，S期细胞比率明显降低，且增殖指数也降低，而 G0/G1期细胞比率明显增高，表明GKN2可抑制CD44（+）SGC7901细胞增殖并阻滞细胞于 G0/G1期；GKN2处理组细胞凋亡率（15.540±0.530）明显高于未处理组（8.083±0.480）和不含GKN2的对照组（7.543±0.471），说明GKN2可促进GCSCs的凋亡。
　　结论:GKN2可诱导胃癌干细胞增殖抑制与凋亡，阻滞细胞于G0/G1期，并可抑制其迁移和侵袭能力。

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目录

第1章 绪论

1.1 前言

1.2 技术路线

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

第3章 实验结果

3.1转染实验结果

3.2 Western Blot 验证GKN2转染成功

3.3 蛋白液纯化浓缩后浓度测定结果

3.4 考马斯亮蓝染色观察蛋白分泌情况

3.5 Western Blot 验证分泌蛋白GKN2的表达

3.6 免疫荧光检测SGC7901细胞分选前后CD44的表达情况

3.7 GKN2对人GCSCs增殖的影响

3.8 肿瘤克隆球形成实验结果

3.9 Transwell迁移实验结果

3.10 Transwell侵袭实验结果

3.11 流式细胞术检测GKN2对GCSCs周期分布的影响

3.12 流式细胞术检测GKN2对GCSCs凋亡的影响

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

文献综述:Trefoil factors: Gastrointestinal-specific proteins associated with gastric cancer

基金项目

作者攻读学位期间的科研成果

致谢