AMPKα-PINK1/parkin依赖线粒体自噬途径介导apelin-13促人主动脉血管平滑肌细胞增殖

摘要

目的：Apelin为G蛋白偶联受体APJ的内源性配体，本课题组前期报道ERK1/2及PI3K-Akt等信号通路介导apelin-13促血管平滑肌细胞增殖。单磷酸腺苷活化蛋白激酶AMPKα是能量代谢感受分子，调控细胞增殖。线粒体自噬能够选择性降解损伤的线粒体，影响细胞增殖的过程。本课题观察apelin-13对人主动脉血管平滑肌细胞（HA-VSMCs）中AMPKα、线粒体自噬以及线粒体动力学(线粒体融合及分裂)的作用，并深入探讨AMPKα-PINK1/parkin依赖线粒体自噬途径介导apelin-13促HA-VSMCs增殖的分子机制，课题从 AMPKα及 PINK1/parkin依赖线粒体自噬视角揭示apelin/APJ促HA-VSMCs增殖新机理，apelin/APJ系统有望成为动脉粥样硬化疾病及高血压等血管增生性疾病的发生发展治疗靶点。
　　方法：
　　1.CT血管造影技术分析人主动脉血管动脉粥样硬化病变情况；
　　2.ELASA检测人的血浆中apelin-13的含量；
　　3.HE染色观察双肾双夹高血压大鼠主动脉血管平滑肌组织的形态变化；4.免疫组织化学法检测双肾双夹高血压大鼠主动脉血管平滑肌组织中apelin、APJ、细胞增殖核抗原PCNA、AMPKα、p-AMPKα、PINK1及parkin蛋白的表达；尸检动脉粥样硬化冠状动脉人的血管平滑肌组织中apelin、APJ、PCNA、AMPKα、p-AMPKα、PINK1及parkin蛋白的表达；
　　5.CCK-8检测HA-VSMCs的增殖情况；
　　6.Western-blot检测HA-VSMCs中PCNA、AMPKα、p-AMPKα、PINK1、parkin、Tom20、VDAC1、Mfn1、Mfn2、OPA1及Drp1蛋白的表达；
　　7.生物信息学STRING10.0分析apelin与AMPKα、AMPKα与PINK1、parkin之间的蛋白相互作用；
　　8.透射电子显微镜观察HA-VSMCs中线粒体形态及线粒体自噬；
　　9.RNA干扰：siRNA-AMPKα干扰 AMPKα、siRNA-PINK1干扰PINK1及siRNA-parkin干扰parkin；
　　结果：
　　1.动脉粥样硬化及动脉粥样硬化合并症(高血压、糖尿病及高血脂)人的血浆中apelin-13的含量显著高于同期正常人血浆组；尸检动脉粥样硬化冠状动脉人的血管平滑肌组织apelin、APJ及细胞增殖核抗原PCNA的表达高于尸检正常人的冠状动脉血管平滑肌组织；双肾双夹高血压大鼠主动脉血管平滑肌组织血管壁增生及增厚，且血管平滑肌组织中apelin、APJ及PCNA的表达显著增加；
　　2.Apelin-13浓度（0-1μM,24h）及时间（0-24h）依赖性促进HA-VSMCs增殖及PCNA蛋白的表达；APJ受体拮抗剂F13A(1μM,24h)抑制apelin-13(1μM,24h)对HA-VSMCs增殖及PCNA蛋白的表达；
　　3.生物信息学STRING10.0预测分析apelin与AMPKα存在相互作用；Apelin-13浓度（0-1μM,30min）及时间（0-30min）依赖性上调HA-VSMCs的p-AMPKα水平，对总AMPKα的表达无影响；F13A抑制apelin-13对p-AMPKα蛋白的表达；尸检动脉粥样硬化冠状动脉人的血管平滑肌组织AMPKα及p-AMPKα的表达显著增加；双肾双夹高血压大鼠主动脉血管平滑肌组织中AMPKα及p-AMPKα的表达显著增加；
　　4.Apelin-13诱导HA-VSMCs线粒体自噬体与溶酶体的现象即线粒体自噬；Apelin-13促进HA-VSMCs中线粒体自噬相关蛋白PINK1、parkin、VDAC1及Tom20蛋白的表达；F13A显著抑制apelin-13诱导HA-VSMCs线粒体自噬相关蛋白PINK1、parkin、VDAC1及Tom20的表达；F13A、PINK1-siRNA及parkin-siRNA明显抑制apelin-13引起的HA-VSMCs线粒体自噬体与溶酶体的现象；尸检动脉粥样硬化冠状动脉人的血管平滑肌组织PINK1及parkin的表达显著增加；双肾双夹高血压大鼠主动脉血管平滑肌组织中PINK1及parkin的表达显著增加；Apelin-13增加线粒体分裂蛋白Drp1，抑制线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2及OPA1的表达；F13A抑制apelin-13诱导HA-VSMCs线粒体分裂Drp1蛋白的表达；且F13A促进apelin-13引起的线粒体融合Mfn1、Mfn2及OPA1蛋白的抑制作用；
　　5.生物信息学STRING10.0预测分析AMPKα与PINK1、parkin之间存在蛋白质相互作用；AMPKα-siRNA显著抑制apelin-13诱导的HA-VSMCs线粒体自噬相关蛋白PINK1、parkin、VDAC1及Tom20的表达；AMPKα-siRNA抑制apelin-13引起的HA-VSMCs线粒体自噬体与线粒体融合的发生；
　　6.AMPKα-siRNA、PINK1-siRNA及parkin-siRNA均显著抑制apelin-13诱导的HA-VSMCs增殖作用。
　　结论：AMPKa-PINK1/parkin依赖线粒体自噬途径介导apelin-13促人主动脉血管平滑肌细胞增殖，为动脉粥样硬化疾病及高血压等血管增生性疾病的发生发展提供理论依据。

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主要英文缩略语索引

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第1章绪论

第2章实验材料

1.实验细胞

2.主要试剂

3.主要仪器

第3章 实验方法

1.细胞培养

2.ELASA（酶联免疫吸附法）检测

3.HE（伊红-苏木素）染色

4.免疫组织化学法

5.CCK-8（Cell Counting Kit-8）检测

6.Western blot检测

7.利用生物信息学STRING10.0分析蛋白质之间的相互作用

8.透射电子显微镜

9.RNA干扰技术

10.统计学方法

第4章 实验结果

1.动脉粥样硬化及其合并症人的血浆中apelin-13的含量

2.动脉粥样硬化冠状动脉人的血管平滑肌组织及双肾双夹高血压大鼠主动脉血管平滑肌组织中apelin、APJ及PCNA的表达

3.Apelin-13对HA-VSMCs增殖及PCNA蛋白表达的影响

4.Apelin-13对HA-VSMCs中AMPKα及p-AMPKα蛋白的影响

5.Apelin-13对HA-VSMCs线粒体自噬的影响

6.Apelin-13对HA-VSMC线粒体动力学（融合及分裂）的影响

7. AMPKα是否介导apelin-13诱导HA-VSMCs线粒体自噬的发生

8.AMPKα-PINK1/parkin依赖线粒体自噬是否介导apelin-13诱导HA-VSMCs增殖的影响

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

发表论文

文献翻译

作者攻读学位期间的科研成果

致谢