鹦鹉热衣原体持续性感染经Bcl-2家族蛋白和ERK抑制HeLa细胞凋亡

摘要

背景与目的：细胞凋亡是机体清除病原微生物感染的重要防御机制。本课题组的前期研究表明鹦鹉热衣原体（Cps）感染HeLa细胞后，可通过抑制其凋亡而发挥持续性感染，但其机制尚不明确，本研究旨在观察人重组干扰素-γ（rhIFN-γ）诱导Cps6BC持续感染条件下，观察其对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响，从而初步阐明Cps持续性感染对凋亡的调节机制。
　　方法：体外培养HeLa细胞，加入MOI为2的Cps6BC菌株和35ng/mL rhIFN-γ诱导持续性感染，分别于感染后0、4、8、12、24h收集细胞进行Hochest33258和TUNEL荧光染色观察HeLa细胞凋亡情况；采用间接免疫荧光染色实验（IFA）检测核形态以及细胞色素c（Cyt.C）和线粒体膜电位（MMP）的变化，同时采用Western blot检测Cps持续性感染对HeLa细胞中Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3、Cyt.C、tBid、Bad、Bim、Mcl-1表达水平及ERK磷酸化的影响。
　　结果：
　　（1）Cps6BC持续性感染HeLa细胞0、4、8、12、24h，Hochest33258和TUNEL染色结果显示其凋亡率明显降低，但感染24h后凋亡率有所增高但仍低于对照水平；
　　（2）而Cps持续性感染20h后能显著抑制STS对HeLa凋亡的诱导效应，形态学上Cps持续感染的细胞核与正常HeLa细胞核大小、形态无明显差异；
　　（3）Cps持续感染4h后Caspase3表达逐渐增加，而其活性形式（Cleaved Caspase3）随着时间的延长而逐渐降低；
　　（4）未感染细胞Mcl-1和Bad表达较低。Cps持续性感染4h后，Mcl-1逐渐增加，并持续至24h。而Cps持续性感染4h后，胞内Bad表达明显增高，但在4～24h内呈恒定表达；
　　（5）Cps持续感染4h后，可显著抑制CCCP诱导HeLa释放Cyt.C，并持续至24h；此外，Cps持续性感染后也能一定程度削弱CCCP对MMP的影响；
　　（6）随着Cps持续性感染时间的延长，HeLa细胞BimEL水平随之降低，Bims表达增高。同时细胞内tBid、Cyt.C的表达水平也随着感染时间的延长而逐渐减少；
　　（7）随持续性感染时间的延长，HeLa细胞内Fas及其配体Fas-L的表达水平逐渐减少。细胞内Caspase8,其活性形式Cleaved Caspase8含量也随持续性感染时间延长而降低；
　　（8）Cps持续性感染4～24h，磷酸化ERK水平随着感染时间的增加而增高，并能增强STS处理后ERK的磷酸化水平.
　　结论：Cps6BC持续性感染通过影响Bcl-2家族蛋白Mcl-1、tBid和Bim表达以及ERK磷酸化，最终调控Cyt.C释放和细胞MMP而抑制HeLa细胞凋亡。

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第一章 前言

第二章 实验材料

1主要实验器材

2 鹦鹉热衣原体Cps 6BC标准株

3细胞株

4主要试剂

5主要抗体

6溶液配制

7其他

第三章 实验方法

1细胞的复苏、培养、传代及冻存

2 Cps 的培养和包涵体形成单位计数

3 诱导细胞凋亡及 Cps 持续性感染

4 Hochest 33258及TUNEL染色

5 间接免疫荧光法检测Cyt.C

6 间接免疫荧光法检测线粒体膜电位

7 Western Blot 检测Mcl-1、Bad、tBid、Bim、Cyt.C、ERK蛋白表达

8统计学分析

第4章 实验结果

1 Cps持续性感染抑制HeLa细胞凋亡

2 Cps持续性感染抑制凋亡诱导剂的促凋亡效应

3 Cps持续性感染通过抑制Caspase 3表达抑制细胞细胞凋亡

4 Cps持续性感染上调Mcl-1和Bad表达

5 Cps 持续性感染经线粒体途径抑制 HeLa 细胞凋亡

6 Cps 持续性感染下调 HeLa 细胞内 tBid 和Bim和线粒体 Cyt.C表达

7 Cps持续性感染下调Fas和Caspase 8表达

8 Cps持续性感染通过调控ERK抑制宿主细胞凋亡作用

第5章讨论

第6章 结论

参考文献

综述：衣原体抗宿主细胞凋亡控机制研究进展

攻读硕士学位期间主要研究成果

资助本论文试验的课题项目和平台

致谢