Klotho/FoxO1途径在硫化氢抗血管平滑肌细胞衰老中的作用研究

摘要

研究背景与目的:
　　心血管疾病已经上升为全世界死亡率最高的疾病，随着科技的进步以及医疗水平的提高，心血管疾病的研究和防治也得到了极大发展。其中，衰老对心血管疾病发生发展的影响越来越受到关注和重视。血管平滑肌细胞的衰老是血管衰老的基础，探索其机制对预防血管衰老，防治心血管系统及其他系统衰老相关性疾病具有十分重要的意义。硫化氢（hydrogen sufide，H2S）曾被认为是生物体内的一种代谢废物，现已被证明是体内一种重要的具有生物学活性的气体信号分子。有研究证明，H2S具有延缓细胞衰老的效应，其机制尚待进一步阐明。Klotho基因是一种“抗衰老”基因，目前学术界普遍认为分泌型的Klotho蛋白是一种与人冠状动脉疾病相关的抗衰老激素，可通过抑制FoxO1磷酸化以增强FoxO1活性，继而发挥抗衰老的效应。已有文献报道H2S可调节神经细胞内的Klotho表达。本研究目的在于探索Klotho/FoxO1途径在H2S抗过氧化氢诱导的平滑肌细胞衰老中的作用。
　　方法与结果:
　　1.用H2O2浓度（0、25、50、100、150μmol/L）处理细胞1小时，更换完全培养基，置于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2）中培养24小时。用Western blotting和β-半乳糖苷酶染色的方法检测细胞衰老，选择最适H2O2浓度。结果显示：对照组（0μmol/L H2O2组）、25μmol/L、50μmol/L H2O2组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率分别为5%、10%和13%左右。100μmol/L H2O2组的阳性细胞率显著增多（65%左右），为对照组的13倍（P﹤0.01）。Western blotting检测表示：与对照组相比，100μmol/L H2O2组的P16、P21和P53蛋白表达显著上调，各增加了288.8%、200.8%、175.4%（P﹤0.01）。结果表明，100μmol/L H2O2诱导血管平滑肌细胞衰老效果最佳。
　　2.先分别用0、25、50、100、200μmol/L NaHS处理血管平滑肌细胞30分钟，再用100μmol/L H2O2处理1小时，更换完全培养基，置于培养箱（37℃、95%O2-5%CO2）中培养24小时。然后应用Western blotting检测相关蛋白，并进行β-半乳糖苷酶染色。结果显示：对照组（0μmol/L NaHS组）β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率高，约63%。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L NaHS组的阳性细胞率分别为47%、25%、15%和12%，与对照组比较均降低（P﹤0.01）。Western blotting检测表示：与对照组相比，100μmol/L NaHS组的P16、P21和P53蛋白表达分别降低了143.6%、166.4%、319.6%（P﹤0.01）。200μmol/L NaHS组的P16、P21和P53蛋白表达各降低了197.5%、198.4%、395.1%（P﹤0.01）。结果显示：H2S具有拮抗H2O2诱导的血管平滑肌细胞衰老的作用。
　　3.将细胞随机分为3组，即对照组、H2O2组及NaHS+H2O2组。然后应用Western blotting检测相关蛋白:P16、P21、P53。与对照组相比，H2O2组的Klotho蛋白表达下降了10.6%（P﹤0.01）。与H2O2组比较，NaHS+H2O2组的Klotho蛋白表达增加了43.1%（P﹤0.01）。和对照组比较，H2O2组的p-FoxO1蛋白表达增加了7.4%（P﹤0.01）。与H2O2组比较，NaHS+H2O2组的p-FoxO1蛋白表达减少了30.2%（P﹤0.01）。说明H2S抗血管平滑肌细胞衰老过程中，Klotho蛋白的表达上调，磷酸化FoxO1的表达下调。
　　4.将细胞随机分为4组，对照组、H2O2组、H2O2+NaHS组、H2O2+NaHS+FoxO1 siRNA组。对照组相比，H2O2组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率增加了272.7%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS组与H2O2组相比，阳性细胞率减少了65.5%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS+FoxO1 siRNA组与H2O2+NaHS组相比，阳性细胞率增加了166.7%（P﹤0.01）。H2O2组与对照组相比，P16、P21、P53蛋白表达分别增加了51.1%、76.6%、25.1%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS组与H2O2组相比， P16、P21、P53蛋白表达分别减少了41.2%、45.8%、52.2%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS+FoxO1 siRNA组与H2O2+NaHS组相比，P16、P21、P53蛋白表达分别增加了45.1%、48.9%、49.2%（P﹤0.01）。说明FoxO1为H2S抗血管平滑肌细胞衰老过程中的一个靶点。沉默FoxO1将削弱H2S抗血管平滑肌细胞衰老的作用。
　　5.将细胞随机分为4组，对照组、H2O2组、H2O2+NaHS组、H2O2+NaHS+Klotho siRNA。与对照组相比，H2O2组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率增加了166.7%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS组与H2O2组相比，阳性细胞率减少了75.1%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS+Klotho siRNA组与H2O2+NaHS组相比，阳性细胞率增加了310.2%（P﹤0.01）。H2O2组与对照组相比，P16、P21、P53蛋白表达分别增加了33.8%、82.4%、45.5%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS组与H2O2组相比，P16、P21、P53蛋白表达分别减少了39.4%、43.5%、25.2%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS+Klotho siRNA组与H2O2+NaHS组相比，P16、P21、P53蛋白表达分别增加了30.5%、57.1%、50.7%（P﹤0.01）。结果表明，沉默Klotho显著削弱H2S抗血管平滑肌细胞衰老的作用。
　　结论：
　　H2S可抑制H2O2诱导的血管平滑肌细胞衰老。其机制与上调Klotho的表达，降低FoxO1磷酸化水平，增强FoxO1的活性有关。

目录

声明

英文缩略词

第1章 绪论

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞来源

2.1.2 主要实验试剂

2.1.3 主要实验仪器及耗材

2.1.4 主要化学试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 血管平滑肌细胞的培养与传代

2.2.2 血管平滑肌细胞的冻存与复苏

2.2.3 确定H2O2处理血管平滑肌细胞建立衰老细胞模型的最适浓度

2.2.4 Western blotting

2.2.6 β-半乳糖苷酶染色

2.2.7 siRNA转染

2.2.8 统计学分析

实验结果

3.1 血管平滑肌细胞衰老模型的建立

3.2硫化氢对 H2O2诱导血管平滑肌细胞衰老的影响

3.3 确认FoxO1是否为硫化氢抗血管平滑肌细胞衰老过程中的一个靶点

3.3.1 H2S抗血管平滑肌细胞衰老过程中对Klotho蛋白表达及FoxO1磷酸化的影响

3.3.2 沉默FoxO1表达对硫化氢抗血管平滑肌细胞衰老作用的影响

3.3.3 沉默Klotho表达对硫化氢抗血管平滑肌细胞衰老作用的影响

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

文献综述:硫化氢与MicroRNA的调节作用及其对心血管疾病影响

硕士期间所获科研成果

致谢