利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体MgPa相互作用的宿主蛋白

摘要

[目的]
　　生殖支原体（Mycoplasma genitalium，Mg）是目前已知的能在无生命培养基中生长的最小的原核细胞型微生物。流行病学调查证实Mg与艾滋病、宫颈炎、盆腔炎和不孕不育等多种疾病密切相关。Mg黏附素蛋白（Mycoplasma genitalium adhesion protein, MgPa）是外膜上含量最高的一种蛋白质，它在Mg黏附到宿主细胞及致病中起关键作用。本研究拟采用膜蛋白酵母双杂交方法，筛选MgPa蛋白与人尿道上皮细胞的相互作用蛋白，为研究MgPa蛋白的功能及其在Mg致病中的作用机制提供实验证据。
　　[方法]
　　以pET30a-MgPa为模板，利用PCR扩增MgPa基因，将其连接到 pBT3STE或者pBT3SUC载体，构建酵母双杂交体系中所需要的诱饵质粒pBT3STE-MgPa及pBT3SUC-MgPa。然后将两种诱饵质粒分别转化到酵母菌株NMY32内，在营养缺陷型的培养基中检测它们的毒性和自激活活性。将人尿道上皮细胞（SV-HUC-1）cDNA文库转入到含有pBT3SUC-MgPa诱饵质粒的NMY32酵母，并将其涂布到SD-Trp-Leu-His+5 mM3AT平板上进行筛选。将生长的候选阳性克隆在SD-TL缺陷培养基中再进行划线筛选。检测LacZ报告基因的活性，培养阳性克隆，提取克隆质粒，送公司测序，然后进行序列比对与分析，最后利用生物信息学工具分析这些蛋白的定位情况。
　　[结果]
　　PCR扩增的MgPa片段大小为870 bp，将其连接到pBT3STE或者 pBT3SUC后成功获得诱饵质粒 pBT3STE-MgPa及pBT3SUC-MgPa，然后利用PCR和DNA测序进行验证。结果发现它们都没有自激活功能，pBT3SUC-MgPa活性比pBT3STE-MgPa强。将pBT3SUC-MgPa转化NMY32酵母作为受体酵母细胞，一共筛选到28个阳性克隆，对其进行测序后进行BLAST分析，共筛选出23个不同的蛋白，其中有肿瘤坏死因子受体超家族成员、细胞色素氧化酶亚单位、金属硫蛋白和血清诱导激酶等。定位在细胞膜外的有 H3组蛋白、金属硫蛋白和肿瘤坏死因子受体超家族成员6B。定位在细胞质的有血清诱导激酶（serum-inducible kinase, SNK）和FK506结合蛋白等，定位在线粒体上的有细胞色素酶。
　　[结论]
　　本实验利用膜酵母双杂交系统从人尿道上皮细胞 cDNA文库中筛选得到23个与生殖支原体MgPa蛋白具有相互作用的蛋白。

目录

声明

主要缩略语英文索引

第1章前言

第2章 实验材料

2.1材料

2.2 常用仪器

第3章 实验方法

3.1 诱饵载体构建

3.2 酵母转化

3.3 文库筛选

3.4影印清除

3.5初始阳性克隆鉴定

3.6酵母阳性克隆DNA提取和测序比对

3.7 生物信息学方法分析部分蛋白的定位

第4章 实验结果

4.1 PCR扩增得到MgPa片段

4.2膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒pBT3STE- MgPa和pBT3SUC-MgPa的鉴定

4.3 MgPa自激活检测及功能检测结果

4.4 文库筛选

4.5阳性克隆鉴定

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

附录

文献综述:酵母双杂交技术的研究及应用进展

研究成果及论文

本课题受以下课题资助

致谢