Pokemon对MDA-MB-231细胞增殖和迁移能力的影响及机制研究

摘要

目的:明确 Pokemon对 MDA-MB-231细胞增殖和迁移能力的影响，同时初步探讨相关分子机制。
　　方法:以稳定性高表达Pokemon的MDA-MB-231细胞系作为研究对象，通过MTT实验检测MDA-MB-231细胞的增殖情况，利用平板克隆形成实验探明Pokemon对MDA-MB-231细胞克隆形成能力的影响，运用流式细胞术探究Pokemon与MDA-MB-231细胞细胞周期分布的相关性。以体外培养的MDA-MB-231细胞为研究对象，应用双荧光素酶报告基因活性实验分析Pokemon对CyclinA启动子活性的影响。采用Western Blot方法从蛋白水平了解Pokemon对细胞周期蛋白A（ CyclinA）表达的影响。通过 Transwell试验明确 Pokemon对MDA-MB-231细胞迁移能力的作用，运用蛋白印记法检测 Pokemon对上皮标志物（Clandin-1、ZO-1）和间皮标志分子（Vimentin、TCF-8）的蛋白表达水平的影响。通过流式细胞仪分选体外培养的MDA-MB-231细胞中具有干性特征的CD44high/CD24low和非干性特征的CD44low/CD24high两群细胞，并且使用qRT-PCR技术比较在这两群细胞中Pokemon、TGF-β1及Smand4的mRNA转录水平差异。
　　结果:1.MTT实验说明:Pokemon可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖。2.Pokemon能降低MDA-MB-231细胞克隆形成能力。3.Pokemon可影响 MDA-MB-231细胞的周期分布，使处于S期的细胞数减少，而G2期的细胞数增多。4.Pokemon抑制MDA-MB-231细胞中CyclinA启动子的活性。5.Pokemon抑制CyclinA蛋白的表达水平。6.Transwell实验结果显示:Pokemon可抑制 MDA-MB-231细胞的迁移能力。7.Pokemon可能抑制 MDA-MB-231细胞上皮间质化：促进MDA-MB-231细胞上皮标志蛋白Clandin-1及ZO-1的表达，抑制间皮标志蛋白Vimentin和TCF-8表达。8.在MDA-MB-231细胞中具有非干性特征的CD44low/CD24high细胞群中Pokemon的mRNA转录水平明显高于具有干性特征的CD44high/CD24low细胞群，而TGF-β1及Smand4的mRNA转录水平明显低于CD44high/CD24low细胞群。
　　结论:1）Pokemon抑制MDA-MB-231细胞增殖，使处于S期的细胞数减少，而G2期的细胞数增多，可能与通过抑制CyclinA启动子活性下调CyclinA蛋白表达水平有关。
　　2）Pokemon抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力，与其抑制细胞上皮间质化相关蛋白表达有关。

目录

声明

主要缩略语词及英文索引

第1章 前 言

第2章 实验材料

2.1细胞

2.2试剂

2.3溶液配制

2.4仪器

第3章 实验方法

3.1细胞培养与传代

3.2 MTT法

3.3平板克隆形成实验

3.4细胞周期分布分析

3.5 Western Blot实验

3.6细胞迁移实验

3.7流式细胞术分选CD44high/CD24low和CD44low/CD24high两群细胞

3.8总RNA提取

3.9 逆转录

3.10 qRT-PCR

3.11双荧光素酶报告基因实验

3.12 统计学分析

第4章 实验结果

4.1稳定性高表达Pokemon 的MDA-MB-231细胞系的验证

4.2 Pokemon对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响和机制探讨

4.3 Pokemon对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响和机制探究

第5章 讨 论

第6章 结 论

参考文献

综述: 乳腺癌干细胞相关通路

附录

致谢