自噬蛋白LC3、Beclin1在H2S保护百草枯中毒致大鼠急性肺损伤中表达变化及意义

摘要

目的
　　百草枯灌胃大鼠建立PQ中毒致大鼠急性肺损伤的动物模型，探讨不同剂量的硫化氢对肺组织内自噬作用及其标志性蛋白LC3、Beclin1的表达影响及意义。
　　方法
　　30只健康清洁雄性大鼠适应性喂养1周后,随机分为生理盐水空白对照组（N组，0.9%生理盐水2ml/kg），百草枯染毒模型组（PQ组，百草枯溶液100mg/kg）， H2S低剂量干预模型组（L组,百草枯溶液100mg/kg+NaHS0.78mg/kg），H2S中等剂量干预模型组（M组，百草枯溶液100mg/kg+NaHS1.56mg/kg），H2S高剂量干预模型组（H组，百草枯溶液100mg/kg+NaHS3.12mg/kg），CSE抑制剂PPG干预模型组（P组，百草枯溶液100mg/kg+PPG30mg/kg），每组各5只。依照上述实验分组分别予以生理盐水、百草枯溶液灌胃，3小时后依照分组及其相应的干预方案分别予以生理盐水、NaHS、PPG进行腹腔注射。灌胃24小时后处死所有大鼠，搜集标本，显微镜下观察各实验组大鼠肺组织病理变化；BCA法测定支气管肺泡灌洗液蛋白含量；取肺称重，计算湿/干重比；ELISA法测定血浆 IL-10、TNF-α的含量；Western Blot检测肺组织自噬蛋白 LC3II、LC3I和Beclin1的表达。
　　结果
　　1.肺组织病理形态学改变
　　大体观：N组大鼠肺组织颜色淡红，形态光滑，未见出血点及水肿；PQ组大鼠肺组织呈暗红色，可见出血病灶；L组、M组、H组大鼠肺组织的外观与PQ组比较充血水肿程度依次减轻；P组大鼠肺组织与 PQ组比较损害更重，大面积新鲜出血病灶，充血水肿严重。
　　镜下观：N组大鼠肺泡结构完整，肺间质未见增宽，肺泡腔、肺间质内均未见红细胞及粒细胞，肺泡、支气管无水肿及透明膜形成，无肺不张。PQ组可见肺泡结构遭到破坏不完整、明显肺泡水肿及肺间质增厚、大量红细胞及炎症细胞浸润、大量透明膜形成及广泛肺不张，与 N组肺损伤比较，该组大鼠肺损伤评分明显升高（P<0.01）。与 PQ组肺损伤比较，L组无明显改善，肺损伤评分无明显下降（P>0.05）；与 PQ组肺损伤比较，M组及H组炎性细胞浸润明显减少，肺泡充血水肿减轻，肺不张面积及透明膜形成明显减少，肺损伤评分均降低明显（P<0.01）。与PQ组比较，P组肺泡结构破坏更严重，肺泡广泛充血水肿，肺间质增厚，大量炎性细胞浸润，大量透明膜形成和广泛肺不张，肺损伤评分升高明显（P<0.05）。
　　2.肺湿/干重比（W/D）变化
　　与N组相比，PQ组大鼠W/D值明显增大（P<0.01）；L组与PQ组相比， W/D值可见明显降低（P<0.05）；M组、H组分别与PQ组相比，W/D值均明显降低（P<0.01）,P组与PQ组相比W/D值明显升高（P<0.05）.
　　3.IL-10、TNF-α变化
　　IL-10值的变化：与N组比，PQ组IL-10的含量明显升高（P<0.01）。与PQ组比，L组IL-10含量无明显升高（P>0.05）,而M组、H组血浆IL-10含量与PQ组比较，均明显升高（P<0.01）。与PQ组相比较，P组血浆IL-10含量无明显变化（P>0.05）。
　　TNF-α值的变化：与N组相比，PQ组TNF-α值明显上升（P<0.01）；L组与PQ组相比，TNF-α值未见明显降低（P>0.05）,M组、H组与PQ组相比，TNF-α值均明显降低（P<0.01）,P组与PQ组相比TNF-α值明显升高（P<0.01）。
　　4.BALF蛋白浓度的变化
　　与N组比较，PQ组BALF浓度明显上升（P<0.01）。与PQ组比较， L组BALF浓度无明显下降（P>0.05），而M组及H组BALF浓度与PQ组比较均明显下降（P<0.01）。P组BALF浓度与PQ组比较明显上升（P<0.01）。
　　5.肺组织自噬蛋白LC3、Beclin1的表达变化
　　与 N对照组比较，PQ组 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达明显升高（P<0.01）。与PQ组比较，L组LC3-Ⅰ表达明显下降（P<0.05）；M组及H组LC3-Ⅰ蛋白表达与PQ组比较均明显下降（P<0.01）；P组LC3-Ⅰ蛋白表达与PQ组比较明显上升（P<0.05）。与 PQ组 LC3-Ⅱ蛋白表达比较，L组无明显下降（P>0.05）；M组及H组LC3-Ⅱ蛋白表达与PQ组相比均明显下降（P<0.01）；P组LC3-Ⅱ蛋白表达与PQ组比较明显上升（P<0.01）。与PQ组Beclin-1蛋白表达比，L组无明显下降（P>0.05）；M组及H组Beclin-1蛋白表达与PQ组比均明显下降（P<0.01）；P组Beclin-1蛋白表达与PQ组比较明显上升（P<0.05）
　　结论
　　1.百草枯中毒致大鼠急性肺损伤时，肺组织自噬蛋白 LC3、Beclin1表达明显提高；
　　2.外源性硫化氢可抑制百草枯致大鼠急性肺损伤时的自噬反应，对急性肺损伤起保护作用，其机制可能与下调自噬蛋白LC3、Beclin1蛋白的表达相关。

目录

声明

英文缩写词表

第1章 前言

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3. 统计学处理

第3章 实验结果

3.1 大鼠一般情况

3.2 肺组织形态学及病理学改变

3.3 肺湿/干重比（W/D）的变化

3.4 血清IL-10、TNF-α含量的变化

3.5 各实验组大鼠BALF蛋白浓度的变化

3.6 Western-Blot检测自噬蛋白LC3、Beclin1的表达变化

3.7 TNF-α、IL-10含量与自噬蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达的相关性分析

第4章 讨论

1.百草枯与急性肺损伤之间的关系

2.细胞因子(CK)失衡与百草枯中毒致急性肺损伤

3.硫化氢对百草枯致急性肺损伤中自噬反应的影响

第5章 结论

参考文献

综述：炎性反应与自噬在急性肺损伤中的作用

作者攻读学位期间的科研成果

致谢