TGF-β1/Smad信号通路参与幽门螺杆菌Tipα诱导的胃癌细胞EMT形成

摘要

胃癌（gastric cancer）是消化道常见恶性肿瘤，是发生率世界排名第五位的癌症，其死亡率高达75%，因此探索胃癌的发生、发展机制有非常重要的意义。胃癌的发生发展与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染密切相关，其致病机制也是现在的研究热点。TNF-α诱导蛋白（TNF-α-inducing protein,Tipα）是H.pylori特异性的分泌蛋白，被认为是胃癌发展相关的新的致癌因子。新近研究表明，Tipα能够通过诱导胃黏膜上皮细胞炎症反应、上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）等参与H.pylori致病过程，但其诱导EMT形成的机制仍不清楚，它所涉及的细胞通路也有待进一步研究。因此研究Tipα对胃癌细胞EMT形成的影响及其相关作用机制，可能为胃癌的临床诊断及靶向治疗提供新的靶点。 研究目的：通过H.pyloriTipα处理胃癌细胞系SGC7901细胞，研究Tipα对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学功能影响，探究TGF-β1/Smad信号通路在其中的作用。 研究方法：（1）将含Tipα原核表达载体的大肠杆菌扩大培养，用IPTG进行诱导后，用亲和层析纯化得到大量Tipα蛋白，进一步对该蛋白去内毒素、Western blot鉴定，并测定其浓度；（2）Tipα刺激处理SGC7901细胞，显微镜下观察其形态学变化，通过细胞增殖实验（CCK8法）、流式细胞术分别检测其对细胞增殖和凋亡的影响；（3）ELISA方法分别检测不同浓度Tipα处理SGC7901细胞不同时间对TGF-β1分泌水平的影响；采用TGF-β受体抑制剂LY2109761阻断TGF-β1/Smad信号通路后，qRT-PCR法检测比较EMT相关标志物E-cadherin和α-SMA以及通路相关TGF-β1的mRNA的表达变化，Western blot检测E-cadherin和α-SMA以及通路相关TGF-β1、Smad3、pSmad3的蛋白表达变化；（4）阻断TGF-β1/Smad信号通路后，划痕愈合实验分析Tipα对细胞迁移能力的影响，qRT-PCR法和Western blot法分别检测侵袭相关基质金属蛋白酶MMP9mRNA和蛋白的表达变化。 研究结果：（1）Tipα蛋白刺激SGC7901细胞12h后，显微镜下可观察到SGC7901细胞从椭圆扁平状向梭形改变，同时细胞间变得相对松散，并有伪足出现；（2）Tipα刺激能增强SGC7901细胞的增殖，抑制细胞凋亡；（3）Tipα诱导SGC7901细胞分泌TGF-β1水平增高（以100μg/mLTipα刺激12h增高最显著），E-cadherin表达下降，α-SMA表达增高；阻断TGF-β1/Smad信号通路后，E-cadherin表达增加，α-SMA表达减少，TGF-β1和Smad3表达无明显差异，pSmad3表达增加；（4）Tipα刺激能增强SGC7901细胞的迁移能力及侵袭相关蛋白MMP9的表达，阻断TGF-β1/Smad信号通路后，细胞的迁移和侵袭能力明显受抑制。 研究结论：（1）Tipα能促进SGC7901细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡；（2）TGF-β1/Smad信号通路参与H.pyloriTipα诱导的胃癌细胞EMT形成。

目录

声明

常用英文缩写

第1章 绪 论

第2章 实验材料

2.1主要实验仪器设备

2.2重组菌、细胞株

2.3.1常用试剂盒

2.3.2其它材料与试剂

2.3.3抗体

2.3.4常用试剂配制

2.4 引物设计

第3章实验方法

3.1 Tipα重组蛋白的诱导表达

3.2 Tipα重组蛋白的纯化及鉴定

3.3 纯化蛋白去内毒素

3.4 胃癌细胞系SGC7901细胞复苏、换液、传代及冻存

3.4.1 细胞复苏

3.4.2 细胞换液

3.4.3 细胞传代

3.4.4 细胞冻存

3.5 Tipα刺激处理SGC7901细胞

3.6 实验分组与处理

3.7 CCK8法检测细胞增殖

3.8 流式细胞术检测细胞凋亡

3.9 ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1水平

3.10.1 细胞总RNA提取

3.10.2 RNA质量鉴定

3.10.3 逆转录PCR

3.10.4Real-Time PCR

3.10.5 目的基因mRNA表达结果的计算

3.11 Western-blot检测E-cadherin、α-SMA、MMP9、TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白的表达

3.11.1细胞蛋白的提取

3.11.2 蛋白浓度测定

3.11.3 SDS-PAGE电泳

3.12 划痕愈合试验检测细胞迁移能力

3.13 统计学分析

第4章实验结果

4.1.1 Tipα重组蛋白的表达和纯化

4.1.2Western blot鉴定Tipα重组蛋白

4.2 Tipα刺激对SGC7901细胞形态学、增殖和凋亡的影响

4.2.1 Tipα对SGC7901细胞形态学的影响

4.2.2 Tipα对SGC7901细胞增殖能力的影响

4.2.3 Tipα对SGC7901细胞凋亡能力的影响

4.3 TGF-β1/Smad信号通路参与Tipα诱导SGC7901细胞EMT的形成

4.3.1 Tipα刺激SGC7901细胞对分泌TGF-β1水平影响

4.3.2 TGF-β 受体抑制剂处理对 TGF-β1/Smad 信号通路相关蛋白Smad3表达的影响

4.3.3 抑制TGF-β1/Smad信号通路对Tipα诱导SGC7901细胞EMT相关标志物表达的影响

4.3.4抑制TGF-β1/Smad信号通路对Tipα诱导的SGC7901细胞迁移能力的影响

4.3.5 抑制TGF-β1/Smad信号通路对Tipα诱导SGC7901细胞MMP9表达的影响

第5章 讨 论

第6章 结论

参考文献

综述:幽门螺杆菌与胃癌相关分子机制研究进展

本研究受以下课题资助

作者攻读学位期间的科研成果

致谢