miR-21通过PTEN介导细胞自噬对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响

摘要

目的： 研究miR-21通过调控PTEN对自噬的影响。进一步探讨miR-21调节的自噬对膀胱癌细胞凋亡、增殖的作用及可能的机制。为剖析miR-21对细胞自噬以及膀胱癌的影响奠定基础。 方法： 1.miR-21通过调控PTEN对自噬的影响。 培养人膀胱T24细胞，并构建以质粒为载体转染的miR-21基因沉默T24细胞（miR-21inhibitor组）、mir-21基因过表达T24细胞（miR-21mimics组）为实验组，以质粒空载体转染的T24细胞（miR-21mimics-NC、miR-21inhibitor-NC）为阴性对照组以及另外两组未转染T24细胞（Blank control）为空白对照组，转染48h后，采用miRNA Realtime、RT-PCR和Western Blot分别从mRNA和蛋白水平检测各组细胞的miR-21、PTEN和自噬相关蛋白beclin1、LC3-II，探讨miR-21通过PTEN调节自噬发挥作用的可能机制。 2.研究miR-21通过PTEN介导细胞自噬对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响 甲基偶氮唑蓝(MTT)法查看各组T24细胞的增殖变化情况。流式细胞术(FCM)检测分析细胞凋亡率和细胞周期；并用RT-PCR和Western Blot检测各组细胞周期蛋白cyclinD1和细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平，观察miR-21通过PTEN介导不同细胞自噬水平对细胞增殖凋亡的影响。 结果： 1.miR-21通过调控PTEN对膀胱癌T24细胞自噬的影响 本研究结果表明在干预4h后与阴性对照、空白对照组相比较，miR-21-mimic干预的T24细胞miR-21mRNA明显增加而PTEN和LC3-Ⅱ、beclin1mRNA和蛋白表达水平明显降低，差异均具有有统计学意义（P＜0.05）；同时与对照组相比较，miR-21-inhibitor干预的T24细胞miR-21mRNA明显降低而PTEN和LC3-Ⅱ、becli1mRNA和蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。 2.研究miR-21通过PTEN介导细胞自噬对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响 运用MTT法对不同时间节点（0h、24h和48h）的膀胱癌T24细胞活性进行测定，发现与对照组对比，予miR-21-mimic干预的T24细胞活性呈现对时间的依赖性增长，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。与对照组相对比，予miR-21-i nhibitor干预的T24细胞活性呈现对时间依赖性下降，差异有显著统计学意义（P均＜0.05）。同时miR-21-mimic干预的T24细胞中cyclin D1表达量上升，说明促进细胞增殖。其次我们用流式细胞仪观察到，与空白对照组和miR-21-mimic组比较，miR-21-inhibitor组凋亡率显著升高(P＜0.01)，同时Caspase-3表达量上升，说明Caspase-3被激活，细胞凋亡被诱导。此外通过FCM检测各组细胞周期，发现与空白对照Blank control和阴性对照miR-21mimics-NC相比，miR-21mimics组的G1期细胞增多，G2期的细胞显著减少（**P<0.01），提示细胞发生了G1期阻滞，说明上调miR-21使细胞周期阻滞在G1期。同样的下调mi R-21使细胞发生了G2期阻滞。 结论： 1）miR-21在膀胱癌细胞中可能通过调控PTEN的表达，调节细胞自噬。 2）miR-21通过PTEN介导的细胞自噬，对膀胱癌细胞呈现促进增殖抑制凋亡的表现。