黑果腺肋花楸与越橘的原生质体分离与融合研究

摘要

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）是一种新兴小浆果果树。由于黑果腺肋花楸有利用价值的显性基因的限制，使得通过常规育种手段改良栽培品种受到很大的限制。黑果腺肋花楸果实富含花青素，抗寒、抗病虫害能力强。越橘（Vaccinium spp.）果实的保健功能日益受到重视，除了防止脑神经衰老、增强心脏功能，抗癌抗炎外，还能够有效抗氧化并对视力有很好的保护作用。利用生物技术手段，将越橘与黑果腺肋花楸的原生质体进行融合，有可能克服自然界中形成的物种间的生殖隔离，从而创造出新的优良资源。 本试验首次以黑果腺肋花楸和半高丛越桔‘北陆’的叶片为材料，分别研究了分离原生质体的酶液组成，酶解时间与方法、酶液pH值、渗透压调节剂浓度、离心条件、叶片预处理方法、CPW溶液成分和试管苗酶解前培养基成分改变对原生质体分离纯化的最佳条件，并对这两种植物材料的原生质体进行了初步的融合研究，为黑果腺肋花楸与越桔的体细胞杂交进行初步的探索。试验主要结果如下： 1.腺肋花楸叶片原生质体分离的条件是：25℃±1℃、纤维素酶、果胶酶、甘露醇0.7mol/L+5mmol/LMES，酶解时间8-10小时，酶液pH值6.5-7。 2.黑果腺肋花楸健壮无菌苗顶端1-4片叶剪成1-2mm宽的细条，酶解效果比撕去叶片下表皮好。相同酶解时间内，采用静置避光酶解的作用与30r/min避光摇床振荡酶解没有明显差异，可以使用较为简便的静置酶解法。酶解前将无菌苗进行暗处理反而降低了原生质体的产量和活力。 3.渗透压强度对原生质体的产量限制作用非常明显，0.7mol/L甘露醇处理下黑果腺肋花楸原生质体产量和相邻处理差异很大。 4.黑果腺肋花楸酶解液pH值近中性时，酶解效果较好。在近中性的pH值范围内，酶解后酶解液pH值下降幅度相近。 5.CPW的配方中添加Mg2+可有效提高越橘活原生质体产量。 6.随着离心时间的增加，越橘原生质体产量增高，但原生质体活力先增高后降低。 7.在越橘原生质体分离操作中添加果胶酶，原生质体产量得到提高，以添加0.5g/L果胶酶得到的活原生质体最多，达到3.34×105/gFW。 8.越橘试管苗酶解前培养在蔗糖含量20g/L的培养基中，活原生质体产量最大，达到4.61×105/gFW。 9.观察到单个原生质体粘连过程，原生质体相连处膜组织融合，没有形成完整的异核体，但可以确定25℃±1℃不是黑果腺肋花楸与越橘原生质体融合的最适温度。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章前言

1.1问题的提出

1.2黑果腺肋花楸与越橘研究现状

1.3原生质体融合研究介绍

1.3.1原生质体融合研究历史与进展

1.3.2原生质体融合融合的方法

1.3.3原生质体融合研究成果

1.3.4影响果树原生质体分离与融合的因素

1.3.5目的及意义

第二章材料与方法

2.1材料与设备

2.1.1供试材料

2.1.2设备

2.2试验方法与设计

2.2.1黑果腺肋花楸叶片原生质体分离试验方法与设计

2.2.2越橘叶片原生质体分离方法与设计

2.2.3黑果腺肋花楸与越桔的原生质体融合方法设计

2.3调查指标

第三章结果与分析

3.1黑果腺肋花楸叶片原生质体分离

3.1.1酶种类与浓度对黑果腺肋花楸原生质体分离的影响

3.1.2酶解方法对黑果腺肋花楸原生质体分离的影响

3.1.3酶解时间对黑果腺肋花楸原生质体分离的影响

3.1.4渗透压调节剂对黑果腺肋花楸原生质体分离的影响

3.1.5酶液pH值对黑果腺肋花楸原生质体分离的影响

3.1.6叶片预处理对原生质体活力的影响

3.1.7离心速度和时间对黑果腺肋花楸原生质体分离的影响

3.2越桔叶片原生质体的分离

3.2.1 CPW溶液配方的改变对越橘原生质体分离的影响

3.2.2甘露醇浓度对越橘原生质体分离的影响

3.2.3纯化离心时间对越橘原生质体产量与活力的影响

3.2.4酶种类配比对越橘原生质体分离的影响

3.2.5培养基降糖处理对越橘原生质体分离的影响

3.3黑果腺肋花楸与越橘原生质体的融合

3.3.1温度对原生质体融合能力的影响

3.3.2 DMSO对融合的作用

第四章讨论

4.1植物材料的处理对原生质体分离的影响

4.2酶解液pH值对原生质体分离的影响

4.3原生质体的纯化

4.4原生质体融合

第五章结论

参考文献

图版与说明

致谢