鹿源牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因的克隆与序列分析

摘要

牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD)是由牛病毒性腹泻-黏膜病病毒感染牛引起的以发热、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。BVDV是瘟病毒属的代表种，该病毒只有一个血清型。BVDV可引起牛、羊、鹿、猪多种动物感染。由于鹿是经济价值较高的动物，鹿感染BVDV可造成母畜流产、死胎、弱胎、畸形胎及产下病毒血症仔鹿，还可导致鹿的采食障碍和营养吸收受阻，以致继发感染，严重影响幼鹿的发育和成鹿的生产性能，甚至造成鹿的大批死亡，这将给养鹿业造成严重的经济损失。目前尚没有有效防制本病的疫苗，因此鹿群一旦爆发该病将产生严重经济损失，因此对鹿BVDV的研究就显得尤为重要。鉴于BVDV的流行情况和难以防制的特点，本实验选择了具有良好免疫原性的E2基因为研究对象，通过对E2基因进行克隆与序列分析，为建立诊断方法和研制有效防制BVDV的疫苗打下基础。 本实验采用MDBK细胞从长春某鹿场采集的鹿粪样中分离出一株致细胞病变型BVDV毒株。将分离的毒株接种于MDBK细胞培养增殖，经5-6次连续传代至出现明显的细胞病变，收集细胞培养液，并浓缩病毒。通过对分离株的培养特性、生物学、免疫学特性等进行鉴定，结果表明其基本特性与标准毒株一致；进而进行分子生物学鉴定，通过合成一对BVDV特异性引物对分离毒株进行鉴定，在约300bp处出现目的条带，证明该毒株为BVDV毒株，因此命名为CHL株；同时为鉴定此毒株的基因型，合成一对BVDV基因分型引物，结果在500-750bp处出现目的条带，证明毒株属基因Ⅰ型。 合成一对套式引物F1、F2，R1、R2对E2基因进行扩增，电泳测定用F2/R2扩增F1/R2的PCR产物大小为1.4kb，经回收纯化后，连接于pMD18-T vector，获得重组质粒pMD18-E2，转化Ecoli Top10，经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定和PCR鉴定，对鉴定为阳性的质粒进行测序。测序结果表明CHL株E2基因长为1122bp。从GenBank中搜寻已发表的Deer-GB1，SH9，S10，NewYork-Ⅰ，NADL，Osloss，Oregon CV24，Changchun184， SD-1，ZM-95，Shinara等毒株的E2基因序列，应用DNAstar软件进行核苷酸、推导氨基酸同源性比较，结果分离株与Changchun184株的核苷酸和氨基酸同源性最高，为99.2％；与日本Shinara株的同源性最低，为71.2％：与其它毒株同源性分别为，Osloss92.8％， CV2474.6％， SD-174.6％， NADL73.5％， SH972.7％， ZM72.5％， Deer-GB173％， S1072.1％。系统进化树分析表明，分离株与184和Osloss株的遗传关系较近。通过对E2基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列分析，结果表明，E2基因编码374个氨基酸，含有16个半胱氨酸残基，4个N-糖基化位点，与184株及Osloss株相同。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1粘膜病的历史及其分类地位

2牛病毒性腹泻病毒的生物学特征

3 BVDV的基因组结构及功能

4牛病毒性腹泻-粘膜病的流行病学

5. BVDV生物型转化的分子机制

6. BVDV疫苗研究进展

试验一 鹿源牛病毒性腹泻-黏膜病的分离鉴定

1.材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

试验二 鹿源BVDV分离株E2基因的克隆与序列分析

1材料

2方法

3.结果

4.讨论

5.小结

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介