苏云金杆菌晶体中20-kb DNA与质粒及染色体的序列相关性研究

摘要

该研究通过对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)伴孢晶体中20-kb DNA上含有的cry1Ac基因进行克隆和表达,发现20-kb DNA上存在晶体蛋白基因的全长编码序列.为了进一步分析含有cry基因的20-kb DNA片段的来源,该研究利用PCR和Southern杂交技术对Bt 4.071 8菌株的质粒与染色体上cry基因的分布情况进行检测,发现质粒和染色体上的部分DNA序列与伴孢晶体中20-kb DNA的核酸序列具有很大的相关性,它们均含有cry基因,而且所含cry基因的类型也一致,这为证明Bt中的20-kb DNA来源于质粒或染色体提供了直接的序列依据.1.Bt4.071 8菌株伴孢晶体中20kb DNA上cry1Ac基因的克隆和表达 根据GenBank中cry1Ac基因的核酸序列设计引物,以Bt 4.0718菌株伴孢晶体中的20-kb DNA为模板,扩增含有上游启动序列和下游终止序列的全长cry1Ac基因,将其与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5 α,获得重组菌株DH5 α/pTAc4.对重组质粒pTAc4进行BamHI/SalⅠ双酶切,然后将含有cry1Ac基因的4.2kb的酶切片段克隆到Bt-E.coli穿梭载体pHT304中,得到重组质粒pHAc4.2.Bt4.071 8菌株中cry基因的定位 提取Bt 4.0718菌株的质粒,同时采用脉冲电泳分离该菌株染色体的酶切片段,并将凝胶中的质粒DNA和染色体酶切片段分别转移至Hybond-N<'+>尼龙膜上.利用地高辛对cry1Ac基因保守区段的1.6kb PCR产物进行标记,以此为探针分别与质粒和染色体的酶切片段进行Southern杂交.杂交结果显示在Bt 4.0718的质粒和染色体均存在cry基因.3.Bt 4.071 8菌株染色体上cry基因的鉴定 采用脉冲电泳分离Bt 4.0718菌株的染色体,将染色体DNA带从凝胶上切下,利用透析袋电洗脱法回收染色体DNA,经SalⅠ酶切后作为模板,进行PCR扩增.

目录

文摘

英文文摘

引言

1 Bt杀虫晶体蛋白基因

2 Bt杀虫晶体蛋白的作用机理

3 Bt杀虫晶体蛋白与DNA分子的相互作用

4立题依据和目的意义

材料与方法

1菌株和质粒

2培养基

3试剂

4仪器设备

5研究方法

结果与分析

1Bt4.0718菌株伴孢晶体中与cry1原毒素相结合的20-kb DNA上crylAc基因的克隆、表达

2 Bt 4.0718菌株中cryl基因在染色体和质粒上的定位

3 Bt 4.0718菌株染色体上cry基因的PCR-RFLP分析

讨论

1伴孢晶体中20-kb 上基因的克隆和表达

2 cry基因在Bt 4.0718菌株的质粒和染色体上的定位

3 Bt 4.0718菌株染色体上cry基因的PCR-RFLP分析

4 Bt 4.0718菌株伴孢晶体中20-kb DNA与质粒、染色体的核酸序列相关性

结语

参考文献

附录一

附录二

致谢