蛋白质组学研究相关技术的发展及其在大鼠海马细胞膜蛋白质组研究中的应用

摘要

海马(hippocampus)是大脑颞叶内侧的一个脑结构，是哺乳动物学习和记忆的重要结构区。但纵观海马与记忆的研究领域，无论国内国外都没有研究者涉足海马细胞膜的蛋白质组学研究领域。膜蛋白占人类整个基因组编码蛋白质的近三分之一，在细胞生命活动中发挥着重要作用。基于蛋白质整体水平上的海马质膜蛋白质组研究将有助于阐明海马的神经生物学功能并有可能发现一些新的受体与通道蛋白以及药物靶标。　　本研究从大鼠海马细胞膜的富集，膜蛋白的分离鉴定等几个方面进行了细胞质膜的蛋白质组学研究，采用了不同的分离鉴定技术路线，包括传统的2DE分离结合LC/Q-TOF方法，以及1D-SDS-PAGE分离结合LC/Q-TOF，1D-SDS-PAGE分离结合MALDI-TOF/TOF方法，分别对大鼠海马组织匀浆提取的质膜蛋白以及急性分离培养的海马细胞提取的质膜蛋白质进行了鉴定；建立了细胞质膜的生物素亲和纯化方法，该方法用包裹了链霉亲和素的磁珠纯化标记了生物素的质膜片段，然后使用磁分离器收集磁珠得到纯的质膜部分，再采用高盐高pH溶液洗涤质膜，实验结果显示该方法提取的膜蛋白具有高含量的质膜特异性蛋白Na+/K+ATPase及Caveolin，且不含有胞质特异性蛋白actin，表明该方法能成功地富集膜蛋白，并能除去质膜蛋白鉴定中最大的污染蛋白——与质膜最紧密相连的胞质骨架蛋白的影响。通过对大鼠海马细胞质膜的蛋白质组学研究，探索了一条适合于生物膜蛋白的蛋白质组学研究方法。在用生物素亲和纯化质膜提取的海马细胞质膜蛋白质组中，明确鉴定了118种蛋白质，其中定位在膜上的蛋白质有74个，占62.7﹪，表明该方法完全适合于膜蛋白质的分析鉴定。根据Swiss-Prot/TrEMBL数据库中对蛋白质功能的描述，对鉴定的蛋白质进行了功能分析，表明这些蛋白质主要为受体(receptor)蛋白质、转运(transport)蛋白质、外部酶(exteriorenzyme)、通信(traffic)蛋白质、结构(structure)蛋白质、粘连(adhesion)蛋白质、伴侣(chaperone)蛋白质及其他(other)蛋白质。其中受体蛋白质与转运蛋白质所占比例最高，均达到19﹪；与此同时还发现了一些未知功能的新蛋白质，有待进一步深入分析。本研究证实了质膜上存在的大量蛋白质与细胞内外分子识别、物质及信息交换密切相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写表(中英文对照)

1.蛋白质组研究中的样品制备技术

1.1蛋白质的分步抽提技术及亚细胞分级分离技术

1.2磁式分离技术

1.3激光捕获显微切割技术

2.蛋白质组研究中的样品分离技术

2.1二维凝胶电泳技术

2.2多维色谱技术

2.3毛细管电泳技术

3.蛋白质组研究中的样品鉴定技术

3.1蛋白质组研究中质谱仪器的最新进展

3.2蛋白质组研究中以质谱为基础的分离鉴定技术最新进展

参考文献

第二章蛋白质组学鉴定技术方法学研究

第一节肽质量指纹图分析方法的建立与优化

1.材料与方法

2.结果与讨论

参考文献

第二节MALDI-TOF源后衰变从头测序方法学研究之一3-磺酸丙酸N-羟基琥珀酰胺酯修饰

1材料和方法

2.结果和讨论

参考文献

第三节MALDI-TOF源后衰变从头测序方法学研究之二磺基异硫氰酸苯酯(SPITC)修饰

1材料和方法

2.结果和讨论1

2.结果和讨论2

参考文献

第四节MALDI-TOF质谱测定多肽C端序列方法的建立

1材料和方法

2.结果和讨论

参考文献

第五节SPITC化学辅助方法鉴定磷酸化肽修饰位点

1材料和方法

2.结果和讨论

参考文献

第三章大鼠海马细胞质膜的蛋白质组研究

第一节生物膜蛋白质组学研究的意义和背景

第二节海马组织细胞质膜的蛋白质组研究

1实验材料

2实验方法

3结果与讨论

第三节细胞质膜的生物素化亲和纯化方法的建立

第四节海马细胞质膜的蛋白质组鉴定

1.材料

2.方法

3.结果与讨论1

3.结果与讨论2

3.结果与讨论3

参考文献

第四章主要研究结果与进一步研究设想

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致谢

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