kisspeptin促进牛颗粒细胞凋亡机制研究

摘要

细胞凋亡是维持机体内环境平衡、排出机体不必要、有害细胞等的过程，又称为程序性死亡。哺乳动物卵巢卵泡发育过程中，卵巢上所有的卵泡都要经历退化、闭锁的过程，只有少数卵泡发育成熟。颗粒细胞在卵泡发育过程中发挥关键作用，并且与卵泡闭锁等过程密切相关。Kisspeptins（Kp）是由 KiSS-1 基因编码的肽类激素，通过G蛋白偶联受体（G protein-couple receptor-54）GPR54发挥作用。Kp通过调节下丘脑GnRH分泌，影响促卵泡素和促黄体素的分泌，在下丘脑、肝、胰、胎盘、卵巢等组织中有表达。本实验室前期研究发现，Kp 在牛卵巢颗粒细胞上有表达，并能促进牛颗粒细胞凋亡，但其调控机制尚不清楚。 本试验选用100 nM的kp-10处理牛颗粒细胞24 h，利用miRNA-mRNA测序关联分析技术筛选参与kisspeptin促进牛颗粒细胞凋亡的miRNA及其靶基因。根据miRNA-mRNA联合分析结果，获得114个差异表达的mRNAs，61个差异表达的miRNAs，2438个GO富集功能差异的miRNA-mRNA，9个差异显著的KEGG信号通路。荧光定量PCR法验证部分差异表达的miRNA和mRNA表达量，结果与miRNA-mRNA联合分析测序技术基因表达结果趋势相同，证明高通量结果的准确性。 根据miRNA-mRNA联合分析结果发现，miR-27b与SFRP2可能参与Kp对牛颗粒细胞凋亡的促进作用。利用双荧光素酶试验明确miR-27b与SFRP2的靶向关系。成功构建了 SFRP2 基因 3’-UTR 端的重组型及突变型载体，选用psiCHECK-2 质 粒 ， 构 建 psiCHECK-2-SFRP2-3’-UTR 、 psiCHECK-2-mut-SFRP2-3’-UTR重组载体质粒，成功转染到293T细胞，通过检测萤火虫及海肾型荧光素酶的活力比值，明确了SFRP2与miR-27b的靶向关系。miR-27b能与 SFRP2-3’UTR 端靶标位点结合，抑制转录后 SFRP2 的表达，荧光定量 PCR法进一步验证miR-27b与SFRP2靶向关系，证实SFRP2是miR-27b的靶基因。 利用流式细胞术、荧光定量 PCR 法和细胞转染等技术研究 kisspeptin 与miR-27b及其靶基因SFRP2在调节牛颗粒细胞凋亡中的关系，揭示kisspeptin调控牛颗粒细胞凋亡的机制。研究发现，miR-27b mimic促进颗粒细胞增殖，抑制颗粒细胞凋亡，miR-27b inhibitor促进牛颗粒细胞凋亡（P<0.05），提示miR-27b可抑制牛颗粒细胞凋亡;miR-27b mimic与kp-10共同作用促进牛颗粒细胞凋亡， miR-27b inhibitor与kp-10共同作用显著促进牛颗粒细胞凋亡。流式细胞术显示SFRP2 siRNA显著抑制牛颗粒细胞凋亡，促凋亡基因caspase-3表达量显著下降，抗凋亡基因Bcl-2基因表达量显著升高。miR-27b mimic与SFRP2 siRNA共同作用抑制颗粒细胞凋亡，miR-27b inhibitor与SFRP2 siRNA共同作用促进牛颗粒细胞凋亡（P<0.05）。 本试验结果表明，Kp通过miR-27b靶向SFRP2基因表达调节而促进牛颗粒细胞凋亡。研究结果不仅揭示了kisspeptin调控牛颗粒细胞凋亡的分子机制，而且丰富了牛颗粒细胞凋亡的调控网络。

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