1.蜘蛛毒素中电压门控性钠离子通道结合蛋白的筛选;2.两个虎纹捕鸟蛛毒素多肽基因的表达及功能初探

摘要

第一部分蜘蛛毒素中电压门控性钠离子通道结合蛋白的筛选 TTX-r型的钠离子通道蛋白Nav1.8主要在致痛性神经元中表达，在疼痛的产生中发挥着关键的调控作用。筛选Nav1.8通道蛋白特异性抑制因子，对于进一步研究钠离子通道蛋白的生物学功能和设计高效安全的临床镇痛药物的设计都具有极为重要的意义。天然多肽类生物毒素为离子通道的研究提供了极为丰富的资源。虎纹捕鸟蛛的粗毒中至少含有400种多肽分子，为新型钠离子通道蛋白阻断因子的筛选提供了一个非常理想的资源库。 本研究旨在为从虎纹捕鸟蛛的毒腺cDNA文库中筛选编码可以与钠离子通道蛋白相互作用的多肽分子基因建立筛选的技术平台。我们选取Clontech公司的MatchMaker Ⅲ酵母双杂交系统。以Na、1.8的DIV的S5-S6的跨膜区段为诱饵，从虎纹捕鸟蛛毒腺cDNA文库中筛选与之相互作用的多肽分子基因。 我们将Nav1.8的DⅣ的S5-S6片段构建在pGBKT7载体上，转化入AHl09酵母菌株，并检测其有无自激活现象。发现Bait无自激活现象后，采用顺序转的方式将虎纹捕鸟蛛毒腺cDNA文库转入带有诱饵的酵母细胞中，涂板在SD/-Trp/-Leu/-His平板上，共长出22个克隆。将这22个克隆在涂有X-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上划板，共得19个蓝斑。提取蓝斑质粒测序后，发现有部分重复序列，总结归纳后共得6个不重复序列。对进行自激活和再次互筛验证，其中有4个蓝斑的AD质粒转化后有自激活现象，两外两个蓝斑质粒在再次互筛验证试验中不显蓝色。实验表明所得的19个蓝斑均为假阳性。此外本实验还比较了X-α-gal和X-β-gal两种显色试剂显色速度的快慢和性能优劣，琼脂板分析法和滤纸分析法两种显色方法，探索了优质的制备电转化感受态方法和酵母质粒提取方法。为今后的进一步筛选研究工作打下了基础。 第二部分两个虎纹捕鸟蛛毒素多肽基因的表达及功能初探 我们在虎纹捕鸟蛛cDNA文库中克隆到两个类似毒素的分子，分别命名为HWTX-713和HWTX-671。HWTX-713含有三对半胱氨酸，理论分子量为3733.52。它在整个cDNA文库中的丰度为1/468，且在虎纹捕鸟蛛毒素蛋白质组学研究和以前的分离纯化中未曾分离到过。我们采用表达的方法获得这个特殊的毒素分子，并尝试对其进行进一步研究。我们采用酵母表达系统，pVT102U/α载体，S78菌株来表达这个毒素分子。将HWTX-713编码成熟肽部分的cDNA克隆到pVT102U载体上进行分泌表达。经纯化，获得HWTX-713毒素的表达量为10mg/L，且能形成三对二硫键。该毒素对小鼠和蜚蠊均未表现出毒性。膜片钳实验表明，HWTX-713对大鼠DRG细胞和蜚蠊DUM细胞上的电压门控钠、钾、钙离子通道均没有可见影响。抗菌活性实验表明它对大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，金黄葡萄球菌，伤寒杆菌，绿脓杆菌均无抑制作用。有关这个毒素的活性和意义有待进一步探讨。 HWTX-671是一个与SHL-I有77％氨基酸序列相似性的毒素，含有三对半胱氨酸，末端含有酰胺化信号-GRR。在虎纹捕鸟蛛毒素组学研究中曾分离到C-末端发生酰胺化修饰的HWTX-671，但因含量非常低无法进一步开展研究工作。为进一步研究这个毒素分子，我们决定采用真核表达的方式获得更多毒素量。在pVT102U载体，S78菌株这个真核表达系统的表达中，由于其-C末端切割不均一，且无法正确形成酰胺化修饰，表达量非常低。我们对分子进行改造，使其末端为-G，和-*，获得的表达量分别为590μg/L，600μg/L。对其进行红细胞凝集试验发现，它们都能使人血红细胞凝集，最低有效浓度分别为1.5mg/mL，5.9mg/mL。

目录

论文说明：中英文缩略词表

声明

中文摘要1

英文文摘1

中文摘要2

英文摘要2

第一部分蜘蛛毒素中电压门控性钠离子通道结合蛋白的筛选

第一章前言

1.1钠离子通道特异性阻断剂的筛选与镇痛药物的开发

1.2酵母双杂交简介

1.3本文研究的意义与思路

第二章蜘蛛毒素中电压门控性钠离子通道Navl.8 domain Ⅳ结合蛋白筛选技术平台的建立

2.1材料与试剂

2.2方法

2.3实验结果

2.4讨论

参考文献

第二部分两个虎纹捕鸟蛛毒素多肽基因的表达及功能初探

第一章酵母表达系统在毒素表达中的应用概述

1.1酵母表达系统遗传背景概述

1.2巴斯德毕赤酵母表达系统

1.3酿酒酵母表达系统

第二章虎纹捕鸟蛛毒素713的表达和功能初探

2.1前言

2.2材料

2.3方法

2.4实验结果

2.5讨论

第三章虎纹捕鸟蛛毒素-671的表达和功能初探

3.1前言

3.2材料

3.3方法

3.4实验结果

3.5讨论

参考文献

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