转玉米ZmPCK1基因对光合作用的功能分析

摘要

玉米是重要的C4光合作物;是我国重要的饲料、工业原料和粮食作物。PEPCK是开花植物中重要的代谢调控酶;是 C4植物 C4光合途径中的关键酶;ZmPCK1 基因是玉米PEPCK 中 C4光合途径中的重要基因。本研究利用农杆菌介导法将携带 ZmPCK1 基因的CRISPR载体;RNAi载体和超表达载体分别转入玉米自交系H99中;经后代分子生物学检测获得ZmPCK1基因的三种载体的转基因阳性植株。通过对T3代转基因阳性植株光合指标测定、功能验证及农艺性状检测;初步分析ZmPCK1基因对玉米光合作用的调控和功能机制;为高光合效率的玉米新种质的创制及新品种的培育奠定基础。本实验研究结果如下： 1.对玉米愈伤组织遗传转化的最优条件进行研究;各个因素对抗性愈伤组织得率影响依次是菌液浓度>共培养时间>侵染时间>As 浓度;抗性愈伤组织得率的最优组合条件为A2（OD600=0.5）、B3（250μmol/L）、C1（30min）、D2（3d）。 2.农杆菌介导法转化玉米自交系 H99 ;经抗性筛选、PCR、Southern blotting 和SDS-PAGE检测;分别获得CRISPR载体、RNAi载体和超表达载体T0代阳性植株4株、4株和5株;T1代阳性植株6株、5株和5株;T2代阳性植株6株、3株和4株;T3代阳性植株5株、4株和4株。经荧光定量PCR检测; T2、T3代阳性植株的ZmPCK1基因表达量大小均为叶片>颈端>根尖;超表达载体>RNAi载体>CRISPR载体。 3.对CRISPR载体T3-3-1株系下的两个突变体植株进行测序分析;结果表明;两个突变体植株的序列较于未转化植株均有片段缺失;且两个突变体的序列缺失片段相同;均在靶序列位置出现了AGCTCGGCG碱基缺失的突变。 4.对不同时间T3代阳性植株净光合速率分析比较;14:00时三种载体阳性植株及未转化植株均达到Pn最大值;且在10:00-14:00光照强度较强时;所有植株Pn值均随着光照强度的增强而变大;其中净光合速率大小为超表达载体植株>未转化植株>RNAi 载体植株>CRISPR载体植株。 5.对三种载体阳性植株净光合速率分析比较;10:00-14:00时超表达载体与其它两个载体差异均为极显著差异。对比CRISPR和RNAi载体;两者在8:00和16:00时差异为显著差异;10:00-14:00差异为极显著差异。对PEPCK基因检测分析;T3代超表达阳性植株叶片经DCDP处理后其Pn值有大幅度下降;并且接近于未转化植株Pn值。 6.对T3代阳性植株的叶、茎、根三个部位进行酶活性测定分析;不同载体不同部位的PEPCK酶活性变化为超表达载体>RNAi载体>CRISPR载体;每个载体植株不同部位的酶活性均为叶大于茎和根。分析玉米转基因植株酶活性与净光合速率的相关性;两者呈极显著正相关;决定系数为0.8256。 7.对 T3代阳性植株农艺性状分析;T3-9-3-3 与对照株高有显著性差异;T3-3-1-4 和T3-9-3-1与对照穗长有显著性差异;T3-3-1-2、T3-9-3-3、T3-14-1-3和T3-14-1-4与对照穗粗有显著性差异;8株百粒重与对照百粒重差异为显著性差异;2株为极显著差异。

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