四种作用于钠通道的蜘蛛毒素的结构与功能研究

摘要

1.敬钊缨毛蛛是2001年在我国海南省乐东县发现的捕鸟蛛科新种，结合阳离子交换和反相高效液相色谱技术，我们从粗毒中分离到两种新的多肽。对其测序并分别命名为敬钊缨毛蛛毒素—Ⅱ（JZTX—Ⅱ）和敬钊缨毛蛛毒素—Ⅳ（JZTX—Ⅳ）。分别描述如下：（a）JZTX—Ⅱ由32个氨基酸残基组成，选择性作用于大鼠心肌细胞，延缓其河豚毒素不敏感（TTX—R）钠通道的失活，IC50为0.26±0.09μM。虽然对大鼠DRG神经元上TTX—R型钠通道没有影响，但对其河豚毒素敏感（TTX—S）型钠通道有延缓失活的活性并伴有微弱的抑制峰电流活性，其IC50为0.83±0.15μM。JZTX—Ⅱ还有延缓昆虫神经元TTX—S钠通道失活的活性，其IC50=1.9±0.07μM。对于大鼠海马神经元TTX—S钠通道，JZTX—Ⅱ没有表现有意义的影响。除了与JZTX—Ⅰ有56％的序列一致性外，JZTX—Ⅱ与所有已知的多肽毒素序列同源性都低，预示着JZTX—Ⅱ是一种新型、高选择性蜘蛛多肽毒素。（b） JZTX—Ⅳ由34个氨基酸残基组成，其C末端被酰胺化，是一个比较少见的酸性多肽。电生理活性实验表明JZTX—Ⅳ能抑制大鼠背根神经节（DRG）神经元TTX—S钠通道的失活，伴有弱的抑制峰电流的活性，其IC50=1.77±0.29μM，JZTX—Ⅳ还使稳态激活曲线往去极化方向漂移，与经典的位点4毒素相反。虽然JZTX—Ⅳ对大鼠DRG神经元上的TTX—R钠通道不敏感，但有明显抑制心肌细胞TTX—R钠通道的作用，其IC50=0.90±0.17μM，而且使稳态失活曲线往超极化方向漂移，不同于经典的位点3毒素。研究表明JZTX—Ⅳ对海马神经元钠通道没有表现活性。 2.HWTX—Ⅰ是虎纹粗毒中含量最高的毒素，一种突触前N—型钙离子通道抑制剂。实验证明HWTX—Ⅰ对大鼠DRG神经元N—型钙通道和TTX—S钠通道具有抑制作用，半有效浓度分别为55nM和100nM。研究结果表明HWTX—Ⅰ对钙通道的选择性高于MVIIA，与GVIA有相同的专一性。同时，HWTX—Ⅰ是第一个在虎纹捕鸟蛛粗毒中被发现的类似于μ0—conotoxins MrVIA和MrVIB的跨通道活性多肽。我们从头化学合成了HWTX—Ⅰ，复性后的HWTX—Ⅰ通过质谱、反相色谱和电生理活性实验鉴定表明合成HWTX—Ⅰ具有与天然HWTX—Ⅰ完全相同的性质和功能。结果表明合成的HWTX—Ⅰ能完全抑制蜚蠊背侧不成对中间（DUM）神经元和大鼠海马神经元钠电流，半有效浓度分别为4.58±0.58nM和66.1±0.52nM。进一步研究表明高于IC50的浓度下，HWTX—Ⅰ对大鼠DRG、海马、蜚蠊DUM神经元的稳态激活和稳态失活曲线均没有影响。 3.海南捕鸟蛛毒液中分离到海南捕鸟蛛毒素—Ⅶ（HNTX—Ⅶ）组成，HNTX—Ⅶ由33个氨基酸残基组成。电生理学实验结果显示HNTX—Ⅶ能抑制大鼠DRG神经元的TTX—R和TTX—S钠通道，也抑制大鼠海马神经元的TTX—S钠通道和蜚蠊DUM神经元的TTX—S钠通道，其IC50分别为0.676±0.049μM、0.169±0.046μM、1.10±0.09μM、15.1±2.7nM。 HNTX—Ⅶ对大鼠TTX—S钠通道和TTX—R钠通道的激活曲线和失活曲线没有明显影响，但可使大鼠海马神经元TTX—S钠通道激活曲线往去极化方向漂移10mV，失活曲线往超极化方向漂移13.4mV。HNTX—Ⅶ对不同钠通道亚型动力学有不同影响，也许是一个很好的研究钠通道动力学的工具分子。研究同时表明HNTX—Ⅶ是一种强的昆虫钾通道抑制剂，其IC50为13.7±1.2nM。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 作用于电压门控钠通道的蜘蛛毒素研究进展

1.1电压门控钠通道

1.2蜘蛛电压门控钠通道毒素

1.3电压钳和膜片钳技术在钠通道及其毒素研究中的应用

1.4开展本课题研究的背景和意义

第二章 敬钊缨毛蛛毒素-Ⅱ和敬钊缨毛蛛毒素-Ⅳ的结构与功能研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

第三章 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ双通道功能活性研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

第四章 海南捕鸟蛛毒素-Ⅶ的分离纯化及活性鉴定

4.1前言

4.2材料和方法

4.3结果

4.4讨论

第五章 主要研究结论与进一步研究设想

5.1主要研究结论

5.2进一步研究设想

参考文献

附 录缩写表

论文发表情况

致 谢