多倍体鱼转座子的遗传变异和雌核发育鱼性腺发育的分子生物学研究

摘要

基因组内独立的DNA序列的转座子（transposons），在物种进化过程中有重要的作用。它能够从一个位置转出，然后插入到另一个位置。转座子通过转出和插入方式，改变生物基因组或基因结构，为生物多态性和物种分化提供了重要来源。对转座子的研究除能揭示其结构和功能外，还在物种的起源和进化、基因组的多态性，以及基因顺次表达调控等方面具有重要意义。红鲫（♀）（Carassius auratus red var）和团头鲂（♂）（Megalobrama amblycephala）亚科间的远缘杂交，成功的培育出了三倍体鲫鲂和四倍体鲫鲂。本文研究了四倍体鲫鲂、三倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂基因组内DNA转座子的拷贝数，转座子Tcl的分子结构和遗传特征；比较研究了不同倍性鱼中高迁移率族蛋白编码基因核苷酸和氨基酸序列的相似性，探讨了该蛋白与DNA转座子相互作用的关系；基于多倍化的异源四倍体鲫鲤、通过雌核发育技术、构建的二倍体杂交克隆系平台，利用抑制性消减杂交技术，研究了二倍体杂交鱼形成二倍体卵子的分子机制。本论文的主要研究内容如下： 1、利用流式细胞仪技术，测定了团头鲂单倍体基因组大小为1.55pg（1438 Mb），该基因组中检测到一种新的DNA转座子，命名为Tmal，该转座子属于TCI家族的第3群。斑点杂交检测，其在团头鲂基因组中具有670个考贝，并经Southern blot杂交验证。Tmal推测的转座酶氨基酸序，经与分子重组恢复活性的鲑科鱼类转座子比对，发现具有一个类似配对的锌指环结构、一个类GRR的AT锚定基序，以及双价核定位信号。由于Tmal序列已积累了多个内部终止子，表明Tmal已在宿主内失去转座活性。这是首次报道了团头鲂基因组中的DNA转座子。 2、以团头鲂为父本、红鲫为母本的远源杂交，导致父本Tmal从杂交后代四倍体鲫鲂基因组中完全切离，而在杂交后代三倍体鲫鲂基因组中，Tmal序列仅发生碱基转换和插入突变，表明在远源杂交过程中，转座子具有2种分子遗传变异方式：（1）垂直失活，转座子以点突变的方式积累突变；（2）随机丢失，转座子以切除方式脱离于杂交后代基因组。 3、通过PCR方法，在4nRB基因组中检测到一种新的转座子，命名为Ttel，属于TC1家族的第1群。斑点杂交检测，在大小为1.76 pg的四倍体鲫鲂基因组中，该转座子具有880个拷贝数。本研究首次报道了脊椎动物远源杂交导致了转座子迸发。 4、利用RACE技术，获得了三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因mRNA全长序列，其开放阅读框包含579nt，翻译成193个氨基酸。序列比较分析表明：核苷酸水平上，四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性（99％）高于同父本团头鲂的同源性（97％），三倍体鲫鲂与父母本同源性（95％）低于亲本之间的同源性（98％）；氨基酸水平上，四倍体鲫鲂与父母本的同源性（100％）高于三倍体鲫鲂与双亲的同源性（97％）。结果表明：远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击，分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异；四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与双本的完全一致性，克服了等位基因的杂交不亲和性，为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础。 5、采用抑制性消减杂交技术，异源四倍体鲫鲤雌核发育第3代（G3）卵巢生长期cDNA为驱动方，第4代（G4）卵巢增殖期cDNA为检测方，构建了一个正向消减cDNA文库。通过斑点杂交筛选文库，获得了73个特异于G4表达的克隆，对其中部分克隆进行了测序。BLASTX搜索结果表明，一些克隆cDNA推测的编码蛋白与NCBI数据库内已知序列具有明显的同源性。这些蛋白包括：信号识别颗粒9蛋白，ATP—连接盒转运体蛋白，葡聚糖—葡萄糖融合蛋白，阻止有丝分裂细胞凋亡蛋白等。通过反转录—多聚酶链式反应（RT—PCR）证实上述编码蛋白基因在卵巢增殖期上调表达。这些基因的鉴定，为研究鲫鲤杂交二倍体鱼的卵巢发育的分子调控机制提供了基础。 6、通过定量RT—PCR（Quantitative Real～time PCR），分析了编码阻止有丝分裂细胞凋亡蛋白基因（PMC）的表达变化，在G4卵巢细胞增殖的不同月龄期，PMC mRNA表达量在5月龄最低，6—7月龄相对有所增加，8月龄时显著提高。定量RT—PCR分析结果与雌核发育鱼卵巢增殖期发生核内复制的现象相一致。本研究结果为我们了解二倍体杂交鱼产生二倍体卵子的分子机制提供了线索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章前言和文献综述

1.1 DNA转座子研究进展

1.1.1转座子的结构和分类

1.1.2转座子的转座机理

1.1.3转座子对基因组进化的影响

1.1.4鱼类DNA转座子

1.1.5展望

1.2高迁移率族蛋白研究进展

1.2.1HMGB1的分子结构

1.2.2HMGB1的分子进化

1.2.3HMGB1的核内功能

1.2.4 HMGB1的核外功能

1.2.5HMGB1与转座子

1.3抑制性消减杂交技术介绍及应用

1.3.1基因差异表达研究技术

1.3.2 SSH技术原理

1.3.3 SSH技术操作流程

1.3.4 SSH技术研究应用

1.4本项研究的目的和意义

第二章TC1转座子在多倍体杂交鱼内的遗传变化

2.1材料和方法

2.1.1动物和杂交

2.1.2基因组DNA的提取和PCR扩增

2.1.3序列分析

2.1.4 PCR扩增转座子的侧翼序列

2.1.5基因组大小的测定

2.1.6斑点杂交

2.1.7 Southern Blot杂交

2.1.8聚类分析

2.2结果

2.2.1多倍体杂交鱼

2.2.2不同倍性鱼的Tc1转座子

2.2.3团头鲂分离出转座子Tma1的特征

2.2.4四倍体鲫鲂转座子Tte1

2.2.5侧翼序列分析

2.2.6 Tma1的分子遗传变异

2.2.7不同倍性鱼基因组大小

2.2.8不同倍性鱼的Tc1拷贝数

2.2.9Tma1的聚类分析

2.3讨论

第三章不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白基因克隆和原核表达

3.1材料与方法

3.1.1材料和试剂

3.1.2总RNA提取

3.1.3引物设计与RT-PCR扩增

3.1.4 RACE PCR克隆HMG1基因末端序列

3.1.5序列拼接和同源性分析

3.1.6生物信息学和系统进化分析

3.1.7重组HMG1原核表达载体的构建

3.1.8原核表达和SDS-PAGE检测

3.2结果

3.2.1总RNA提取和RT-PCR扩增结果

3.2.2HMG1基因cDNA全长拼接及同源性比较

3.2.3HMG生物信息学分析

3.2.4HMG1系统进化分析

3.2.5原核表达及SDS-PAGE检测

3.3讨论

第四章雌核发育鱼卵巢发育基因鉴定和表达分析

4.1材料和方法

4.1.1动物材料

4.1.2卵巢组织学观察

4.1.3 RNA的分离和cDNA的合成

4.1.4抑制性消减杂交

4.1.5构建SSH文库

4.1.6斑点杂交筛选SSH文库

4.1.7序列分析

4.1.8基因表达的RT-PCR分析

4.1.9定量RT-PCR分析

4.1.10 PMC基因的RACE-PCR克隆和组织表达分析

4.2结果

4.2.1性腺结构观察

4.2.2增殖期卵巢cDNA接头连接效率

4.2.3消减文库cDNA克隆片段大小的鉴定

4.2.4筛选抑制性消减杂交文库

4.2.5差异表达基因的序列分析

4.2.6基因的表达分析

4.2.7 PMC基因的定量RT-PCR分析

4.2.8 PMC基因的RACE-PCR克隆和组织表达分析

4.3讨论

第五章总结

参考文献

实验主要试剂与配制方法

攻读博士学位期间已发表和待发的学术论文

致 谢