放线菌的两个菌株中重要功能基因的研究

摘要

放线菌中的链霉菌和刺糖多孢菌是产生抗生素的重要来源。链霉菌Streptomyces lydicus产生的利迪链菌素(Streptolydigin)是一类重要的天然产物，为典型的Tetramic acid类抗生素，具有抗细菌活性、抗肿瘤活性、抗HIV蛋白酶活性。为了研究其生物合成途径中主要基因的功能，基于实验室已获得的基因簇，对聚酮合酶(PKS)，两个细胞色素P450氧化酶(P450-1，P450-2)，异柠檬酸脱氢酶(Idha)，转氨酶(Adtf)，2,3-己糖脱氢酶(Hdt)进行了基因中断，获得了同源单交换的中断突变株△PKS，△P450-1，△P450-2，△IDHA，△ADTF，△HDT。经过高效液相色谱(HPLC)和液相色谱和质谱耦连(LC-MS)检测证实中断突变株△PKS，△P450-1，△HDT不产生利迪链菌素或产生微量的利迪链菌素，说明这三个基因是利迪链菌素生物合成所必需的基因。然而中断突变株△P450-2，△IDHA，△ADTF仍然产生利迪链菌素，说明这些基因与利迪链菌素生物合成不相关或者菌体内存在其他基因，替补了这些基因的作用。这为理解利迪链菌素的生物合成提供了一定的基础，为提高利迪链菌素的产量和获得活性好的类似物提供了分子水平的依据。
　　 放线菌刺糖多孢菌，是一种商业杀虫剂Spinosad的产生菌，它能够产生在细胞内和细胞外具有脱氧核糖核苷酸酶活的酶，我们用PCR的方法从刺糖多孢菌中克隆了这些基因，并鉴定到两个脱氧核糖核苷酸酶基因(exoⅠ和exoⅡ)，这两个酶在氨基酸序列上只有29％的同源性。本研究克隆了这两个基因，并在大肠杆菌中进行表达，纯化后对其进行了生化特征的研究。ExoⅠ在大肠杆菌中是以包涵体的形式表达的，通过复性后测定其活性。ExoⅡ通过低温诱导得到可溶性表达。这两个酶都显示了对单链DNA和双链DNA的酶切活性，但它们都需要二价阳离子(Mg2+，Ca2+)发挥活性，并且他们的活性都会受到螯合剂的抑制。这为研究脱氧核糖核苷酸内切酶在刺糖多孢菌发酵过程中所起的作用提供了体外的数据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略表

声明

1.引 言

1.1放线菌概述

1.2放线菌次生代谢产物研究

1.3抗生素生物合成途径的研究进展

1.3.1聚酮抗生素生物合成途径研究

1.3.2聚肽抗生素生物合成途径研究

1.3.3杂合PKS-NRPS的研究进展

1.4利迪链菌素生物合成研究现状及立题依据与意义

1.5多杀菌素研究进展

1.6脱氧核糖核酸内切酶研究现状与立题依据与意义

2.材料与方法

2.1菌株和质粒

2.2培养基与抗生素

2.3试剂与引物

2.3.1放线菌总DNA提取试剂

2.3.2质粒提取试剂

2.3.3蛋白电泳试剂

2.3.4蛋白纯化试剂

2.3.5蛋白测活试剂

2.3.6引物

2.4仪器

2.5方法

2.5.1放线菌总DNA的制备

2.5.2 PCR扩增

2.5.3 DNA连接

2.5.4感受态细胞的制备

2.5.5感受态细胞的转化

2.5.6阳性转化子的筛选

2.5.7利迪链霉菌抗性敏感试验

2.5.8利迪链霉菌的孢子制备

2.5.9接合转移

2.5.10同源重组突变株获得

2.5.11蛋白表达及纯化

2.5.12核酸酶活性的测定

3.结果与分析

3.1利迪链霉菌抗性敏感实验与接合转移

3.1.1利迪链霉菌抗性敏感实验

3.1.2接合转移

3.2细胞色素P450氧化酶1(P450-1)与利迪链菌素生物合成相关性的研究

3.2.1 p450-1基因中断重组质粒的构建

3.2.2 p450-1基因中断株△P450-1的筛选和鉴定

3.2.3 HPLC检测发酵产物

3.3细胞色素P450氧化酶2(P450-2)与利迪链菌素生物合成相关性的研究

3.3.1 p450-2基因中断重组质粒的构建

3.3.2 p450-2基因中断株AP450-2的筛选和鉴定

3.3.3 HPLC检测发酵产物

3.4聚酮合成酶(PKS)与利迪链菌素生物合成相关性的研究

3.4.1 pks基因中断重组质粒的构建

3.4.2 pks基因中断株△PKS的筛选和鉴定

3.4.3 HPLC检测发酵产物

3.5转氨酶(Adtf)与利迪链菌素生物合成相关性的研究

3.5.1 adtf基因中断重组质粒的构建

3.5.2 adtf基因中断株△ADTF的筛选和鉴定

3.5.3 HPLC检测发酵产物

3.6异柠檬酸脱氢酶(Idha)与利迪链菌素生物合成相关性的研究

3.6.1 idha基因中断重组质粒的构建

3.6.2 idha基因中断株△IDHA的筛选和鉴定

3.6.3 HPLC检测发酵产物

3.7 2,3-己糖脱氢酶(Hdt)与利迪链菌素生物合成相关性的研究

3.7.1 hdt基因中断重组质粒的构建

3.7.2 hdt基因中断株△HDT的筛选和鉴定

3.7.3 HPLC检测发酵产物

3.8 exo基因的克隆、表达与蛋白测活

3.8.1 exo-Ⅰ基因表达载体的构建

3.8.2 exo-Ⅰ的表达、Exo-Ⅰ纯化与复性

3.8.3 Exo-Ⅰ的活性测定

3.8.4 exo-Ⅱ基因表达载体的构建

3.8.5 exo-Ⅱ的表达、Exo-Ⅱ的纯化

3.8.6 Exo-Ⅱ的活性测定

4.讨论

4.1两个细胞色素P450氧化酶基因与利迪链菌素生物合成的相关性

4.2其他四个基因与利迪链菌素生物合成的相关性

4.3单交换同源重组获得中断突变株

4.4来源于刺糖多孢菌的两个脱氧核糖核苷酸内切酶

结语

参考文献

附录 硕士期间撰写、发表于课题相关的学术论文

致谢