重组大鼠肾上腺髓质素质粒对力竭运动大鼠心脏缺氧的保护作用的研究

摘要

目的：
　　 通过与真核表达载体pVAX1的重组，构建大鼠肾上腺髓质素真核表达质粒(pVAX1-ADM)。采取肌肉注射法将不同剂量的重组质粒导入大鼠后肢腓肠肌内，建立大鼠力竭缺氧模型，研究重组大鼠肾上腺髓质素质粒对力竭运动大鼠心脏缺氧的保护作用。
　　 方法：
　　 1.构建重组大鼠肾上腺髓质素质粒(pVAX1-ADM)：提取SD雄性大鼠肾上腺组织总RNA，通过RT-PCR逆转录法获得ADM基因的cDNA，进一步扩增cDNA模板并克隆至PMD-18T载体，将克隆产物亚克隆至真核表达载体pVAX1上最终获得重组产物pVAX1-ADM。采取碱性裂解法和聚乙二醇法反复大量提取足够浓度及纯度的重组质粒。
　　 2.雄性SD大鼠18只，体重(203±18.4)g，根据体重完全随机分为3组，6只/组，分别为正常对照组、空载体组和pVAX1-ADM700μg/kg组。3组大鼠分别注射生理盐水1ml、pVAX1质粒DNA生理盐水溶液1ml和700μg/kg剂量pVAX1-ADM生理盐水溶液1ml，1次/周，共注射4周。模型建立完成后，通过免疫组织化学方法对所取大鼠心肌组织进行重组质粒pVAX1-ADM的表达情况进行检测。
　　 3.不同剂量pVAX1-ADM对力竭大鼠心脏的保护作用：雄性SD大鼠48只，体重(223.24±23.77)g，按体重随机分为6组，8只/组，分别为正常对照组(C组)、力竭对照组(Ex组)、还原型谷胱甘肽阳性药物组(G组)，pVAX1-ADM700μg/kg剂量组(P1组)、pVAX1-ADM1100μg/kg计量组(P2组)、pVAX1-ADM1400μg/kg剂量组(P3组)。除正常对照组外，其余5组根据大鼠力竭心脏缺氧模型进行一次力竭性运动。每周给C组、Ex组注射生理盐水1ml，G组注射还原型谷胱甘肽(GSH)0.125g/ml生理盐水溶液1ml，P1、P2、P3组分别注射pVAX1-ADM700μg/kg、1100μg/kg和1400μg/kg生理盐水溶液1ml。第四周大鼠运动至完全力竭后，取大鼠心肌组织测定组织中CK、LDH，MDA及SOD的水平，并对心肌组织作组织形态学观察，同时收集大鼠血液作血浆粘度、红细胞聚集指数、红变形指数等血流变指数检测。
　　 结果：
　　 1.通过与Genebank中所查询的ADM基因序列比较，证实所构建重组质粒DNA序列与之完全一致。同时，经过.XbaⅠ与HindⅢ双酶切鉴定，结果为阳性。通过紫外分光光度法测定经大量提取纯化后的重组质粒的纯度为：0D260=0.924，0D280=0.505，0D260/0D280=1.828，浓度为4.63mg/ml。
　　 2.通过对大鼠腓肠肌组织的组织形态学切片观察，结果显示正常对照组、空载体组心肌组织ADM表达量较低，而pVAX1-ADM700μg/kg组表达量较高。
　　 3.大鼠心肌组织的MDA、T-SOD、CK和LDH的最终检测结果显示，相对于Ex组，P1组、P2组、P3组和G组的CK、LDH和MDA含量均明显降低(P<0.05)，指标结果具有显著性差异(P<0.05)，有统计学意义；T-SOD含量明显增加(P<0.05)，指标结果具有显著性差异(P<0.05)，有统计学意义。组织形态学检测表明与C组相比较，Ex组心肌组织结构损坏严重，炎性细胞聚集，水肿明显。相较于Ex组，P1组、P2组、P3组和G组心肌组织结构损伤情况均得到明显减缓，组织水肿情况有所减轻。大鼠血液血流变检测结果显示，P1组、P2组、P3组和G组的全血高切粘度、全血低切粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数和红细胞变形指数都比Ex组有明显降低(P<0.05)，指标结果之间的差异具有统计学意义；红细胞压积较Ex组的有明显升高(P<0.05)，差异具有统计学意义。
　　 结论：
　　 1.成功构建大鼠pVAX1-ADM重组质粒，通过大量提取纯化所获质粒DNA的纯度及浓度均符合后续实验要求。
　　 2.700μg/kg重组质粒导入大鼠腓肠肌后能使大鼠腓肠肌组织中的ADM表达量上调，以上表明重组大鼠肾上腺髓质素真核表达质粒构建成功，可在大鼠体内正常摄入并表达。
　　 3.700μg/kg、1100μg/kg、1400μg/kgpVAX1-ADM和阳性药物GSH导入后都可提高力竭性运动大鼠心肌组织的SOD活力，降低MDA含量，降低心肌组织内CK活力和LDH含量，改善血流状况，对力竭性运动大鼠的心脏有保护作用且具有一定剂量效应，其中以1400μg/kgpVAX1-ADM的效果最好。