碳纳米管/SYBR GreenⅠ荧光探针在沙门氏菌检测中的应用

摘要

纳米晶体、纳米管等无机材料具有特殊的结构特征，在一些小分子(核酸或蛋白质)的检测中显示出很好的性能。单壁碳纳米管(SWNTs)能够与寡核苷酸的碱基通过π-π非共价键作用形成稳定的状态。同时SWNTs具有抗光漂白作用以及近红外波长的荧光特性。可在生命科学研究中作为荧光探针的载体。本文以SWNTs为载体，借助荧光染料SYBR Green I(SG)特殊的荧光性质，对沙门氏菌属的两种血清型鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行快速检测，主要展开以下两个方面的工作：
　　 1.检测含trps基因的鼠伤寒沙门氏菌。本研究方法利用荧光的淬灭和恢复对含trps基因的鼠伤寒沙门氏菌进行检测，SWNTs对寡核苷酸(ssDNA)特异的结合作用和SG对核酸分子(包括ssDNA和dsDNA)特异的插入作用及极强灵敏性，建立一种快速检测含trpS基因的鼠伤寒沙门氏菌的方法。在本检测体系中，单独存在的SG分子是几乎不能产生荧光信号的。当加入探针分子(ssDNA)后，由于SG和探针DNA的插入作用能够检测到SG的荧光信号(520nm)。随后，SWNTs的加入，由于SWNTs选择性的与探针DNA的非共价作用使得探针DNA分子与SG分离，SG游离而不发荧光，SWNTs间接的淬灭了SG的荧光。当加入靶序列后，靶序列通过与探针DNA分子的杂交作用迅速的形成双链的DNA分子(dsDNA)而脱离SWNTs的吸附作用，SG插入到双链DNA分子中，荧光信号得到恢复。而加入误配碱基序列和其它菌的DNA时，SG的荧光强度不会恢复。实验结果表明，通过检测SG荧光的变化可对携带trps基因的鼠伤寒沙门氏菌进行检测，而且此方法具有高的灵敏性和特异性。通过该方法，浓度为1.8nM的目标DNA可以得到检测。用该方法，在仅仅只加入终浓度为1.8nM目标DNA的情况下，荧光值的恢复率达到了78％。荧光值的增强值达到4.54。特异性检测的结果也证明该检测方法可以区分具有高同源性的核酸序列(1-或3-nt的区别)。此外，这种方法用于含有trps基因的鼠伤寒沙门氏菌的实际样本也有很好的效果，在用菌中提取的DNA的PCR扩增产物时，荧光信号的恢复效果非常好，荧光值的增强值达到了3.15。
　　 2.检测肠炎沙门氏菌的16SrRNA。本研究方法利用荧光的淬灭和恢复对肠炎沙门氏菌的16SrRNA进行检测，SWNTs对寡核苷酸(ssDNA)共价的联接作用以及特异的非共价结合作用和SG对核酸分子(包括ssDNA和dsDNA)特异的插入作用及极强灵敏性，建立一种快速检测肠炎寒沙门氏菌16SrRNA的方法。在本检测体系中，单独存在的SG分子是几乎不能产生荧光信号的。采用一段特异识别肠炎沙门氏菌的DNA探针来特异识别肠炎沙门氏菌的基因组DNA，而通过识别荧光染料SYBRGreenI(SG)的信号来实现检测。该段DNA探针首先将通过连接反应共价的修饰到碳纳米管上并将通过吸附作用缠绕在碳纳米管管壁上，而当体系里加入肠炎沙门氏菌的基因组DNA时，该段核酸序列的游离端将从碳纳米管上解缠绕下来，随后与目标DNA发生杂交反应形成双链结构并与荧光染料SG结合产生信号。实验结果表明，通过检测SG荧光的变化可对肠炎沙门氏菌进行检测，而且此方法具有高的灵敏性和特异性。通过该方法，浓度为1.8nM的目标DNA可以得到检测。对于肠炎沙门氏菌16SrRNA的检测，用该方法，在仅仅只加入终浓度为1.8nM目标DNA的情况下，荧光值的恢复率达到了84%。荧光值的增强值达到13.16。此外，这种方法用于肠炎沙门氏菌16SrRNA基因组的实际样本检测也有很好的效果，在用菌中提取的DNA的PCR扩增产物时，荧光信号的恢复效果非常好，荧光值的增强值达到了12.42。随后还用此方法对肠炎沙门氏菌的16SrRNA进行了检测，效果也十分理想，当将抽提纯化后的16SrRNA稀释到同样浓度加入到反应体系中时，同样使荧光值得到了很好的回复，荧光值的增强值达到9.92。