利用蛋白质免疫印迹技术研究POP3调控心脏发育的分子机制

摘要

脊椎动物的心脏发育过程，是一个多基因调控的复杂的信号网络，其中一些重要的调控因子在心脏发生中的作用引起了发育生物学届的广泛关注。通过鉴定出重要的调控因子，然后调出与其发生相互作用的蛋白，找出其参与的信号通路，对于揭示心脏发育的分子机制有极其重要的作用，也为阐明先天性心脏病发生的分子机制铺平了道路。
　　 POP3基因是POP家族的成员，位于人类染色体的6q21区段。其DNA序列共含有四个外显子和三个内含子，转录后产生两个剪切体，其中一个编码由291个氨基酸组成的蛋白，另一个不编码任何蛋白质。生物信息学分析表明：在其N端有三个跨膜结构域，其C端有一个其基因家族独有的popeye结构域，其中包含一个CNBD(cNMPbindingdomain)结构域，介导POP家族通过其与cNMP的结合，从而发挥调控作用。
　　 POP3基因是一个在心脏和肌肉高水平表达的基因，但其具体的分子调控机制还不清楚。本实验室前期的研究结果显示：POP3与心肌细胞的增值和心脏的大小有关，并通过一系列实验找到了一个与其有相互作用的转录因子ATF4和其潜在的调控靶基因GATA4。GATA4是一个重要的心脏发育的标志基因，能够调节心肌细胞的增殖和特化。免疫共沉淀的实验证实：POP3通过其独特的popeye结构域与ATF4发生相互作用。由此，我们推测：POP3通过与ATF4相互作用后，调节GATA4的表达来调控心脏发育。为了证明这个结论，我们进行了如下实验。
　　 在实验中，我们运用Morpholino的反义敲减和mRNA过表达技术，在斑马鱼胚胎中敲低或过表达POP3，然后利用蛋白质免疫印迹实验来检测其潜在的靶基因GATA4和其调控的心脏发育和细胞周期标志基因的表达。实验结果显示：敲低POP3后，GATA4的表达也受到了抑制，其下游基因.Nkx2.5、dhand、NPPA、ACTC1、CDK4、CyclinD2、Bcl2的表达量也明显的下调。反之，过表达后，它们的表达有明显的上调。POP3转基因斑马鱼的蛋白质免疫印迹实验结果也证明了，在体内过表达POP3，导致GATA4及其下游标志基因的表达明显的升高。
　　 在P19细胞模型中，我们构建了POP3和ATF4的干扰和过表达稳定细胞系，然后利用DMSO定向诱导其分化为心肌细胞。运用蛋白质免疫印迹技术分析它们的直接下游靶基因GATA4及其调控的心脏发育和细胞增值相关的标志基因的表达。实验结果与斑马鱼的结果一致，这就从细胞和斑马鱼的整体两个层次证明了：POP3通过与ATF4相互作用后，调控GATA4的表达，进而调控心脏发育的标志基因和细胞周期相关基因的表达调控心脏的发育。