高效表达几丁质酶基因tchiB苏云金芽胞杆菌工程菌的构建及杀虫活性研究

摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringinsis)是目前最为重要的一种杀虫微生物，广泛应用于农林害虫的生物防治。目前国内外对Bt工程菌的改造拟在完善其杀虫谱较窄、杀虫毒力不高等缺陷，获得性能优良的Bt重组工程菌。有研究报道几丁质酶能够破坏昆虫体内的围食膜，对Bt杀虫晶体蛋白的杀虫活性有着显著的增效作用。
　　 本研究利用Red/ET同源重组技术，将烟草几丁质酶基因tchiB置于cry2Aa基因启动子和cry1Ac基因终止子序列之间，获得嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act。将嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act克隆入穿梭载体pHT315中，获得重组质粒pHTtchiB。将pHTtchiB电转入高毒力Bt库斯塔克亚种(Btsubsp.kurstaki)野生菌株HD73中，获得工程菌株HDtchiB。经SDS-PAGE分析检测，外源基因于Btcry2Aa强启动子下高效表达产生约30kD蛋白；经质谱进一步鉴定其正确表达。用DNS法测定烟草几丁质酶的活性，16h左右酶活力达到最高，为42.827U/mL。HD73和工程菌株HDtchiB发酵产物对棉铃虫初孵幼虫的生物活性测定，72h的LC50分别为264.255μg/mL和167.870μg/mL，较出发菌株HD73显示出更高的杀虫毒力。
　　 外源质粒在Bt工程菌株中容易出现不稳定甚至丢失的情况。为了使外源基因能够稳定的存在于Bt工程菌中，将其整合入Bt染色体是有效措施。本研究选取定位在Bt染色体上的几丁质酶基因作为外源基因的整合位点，构建E.coli-Bt温度敏感型穿梭质粒pKCHIUN。利用Red/ET同源重组技术，构建了含嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act的整合载体pKTCHIUN。拟通过同源重组，将pcry2Aa-tchiB-1Act基因定点整合到Bt无晶体突变株XBU001染色体上，获得外源基因稳定遗传及表达的Bt工程菌株。
　　 本文利用Red/ET同源重组技术便捷高效地构建了穿梭表达载体pHTtchiB及整合载体pKTCHIUN，实现了高效表达烟草几丁质酶基因tchiBBt杀虫工程菌HDtchiB的构建，为研究与cry1Ac具有协同作用的外源杀虫基因克隆入Bt菌株中，构建外源基因高效表达、性能稳定、毒力高的工程菌奠定了重要的研究基础。