多杀菌素对甜菜夜蛾的作用受体及作用机制的初步研究

摘要

多杀菌素类杀虫剂具有高效，安全，广谱等特点，是目前最具潜力的生物杀虫剂之一。研究发现多杀菌素具有独特的杀虫机制，作用时表现出神经毒剂特有的中毒症状。已有的研究认为多杀菌素主要作用于烟碱型乙酰胆碱受体和γ-氨基丁酸受体，但是其具体的作用机制并不明确。
　　 本研究是以具有杀虫活性的多杀菌素浸润叶片喂食甜菜夜蛾，并提取喂食24h的甜菜夜蛾总蛋白。通过比较多杀菌素处理与未处理的甜菜夜蛾的蛋白质组的差异，解析多杀菌素对甜菜夜蛾的作用机制，进而对多杀菌素受体蛋白进行初步研究。实验采用双向电泳技术(2-DE)分离甜菜夜蛾总蛋白，运用Imagemaster6.0对双向电泳凝胶图谱进行斑点检测、分析，找到差异表达的蛋白，通过酶解消化，借助质谱技术和生物信息学软件鉴定了多杀菌素处理与未处理的差异表达蛋白，并对其功能进行了系统的分析。
　　 通过实验，我们获得了多杀菌素处理以及对照的正常幼虫的2-DE图谱。应用Imagemaster6.0软件对扫描得到的2-DE图谱进行检测分析，在相同条件下检测到的蛋白质斑点数分别为多杀菌素处理355个，对照329个。经差异比较和显著性检验共得到25个差异蛋白，其中多杀菌素处理后表达上调的蛋白点13个，表达下调的蛋白点12个。由于蛋白质点低丰度及技术问题的局限，我们对部分差异蛋白进行了质谱鉴定。实验鉴定到了12个表达差异较大的蛋白点(P<0.05)，其中包括羧酸酯酶、细胞色素P450等保护酶，以及ATP酶、蜕皮激素受体蛋白、肌动蛋白等。通过对差异蛋白的分析，发现这些酶等蛋白分子与昆虫的生长发育以及对杀虫剂的应激反应和解毒代谢等功能相关，为阐明多杀菌素的杀虫机理和甜菜夜蛾抗性机制提供了重要依据。
　　 为进一步研究这些蛋白与多杀菌素的作用，本研究选用V-ATPase为研究对象，以巴佛洛霉素A1(V-ATPase抑制剂)与多杀菌素混合使用，对甜菜夜蛾进行生测实验，结果显示加入巴佛洛霉素A1后，多杀菌素杀虫活性提高，并对V-ATPase活性进行了测定，结果显示通过抑制甜菜夜蛾VATPase的活性，使甜菜夜蛾对多杀菌素更加敏感，说明VATPase可能与甜菜夜蛾对多杀菌素的抗性有关。