氨基酸类和丙二醇胺类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价

摘要

基因治疗在肿瘤治疗和遗传病治疗方面有很好的前景，引起了广泛关注。基因治疗面临的最主要的难题是寻找一种高效、低毒的基因转染载体，将基因药物导入特定的细胞中，并能稳定地维持其功能。目前，广泛用于临床的基因载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。而作为非病毒性载体之一的阳离子脂质体在临床试验中具有较好的发展前景。
　　 本论文合成了两类阳离子脂质。一类是以氨基酸为原料，通过Fmoc-氨基保护、酰胺化、Fmoc-氨基脱保护、氯乙酰化和季铵化反应，合成TMA-β-Ala-di-C12和TMA-Val-di-C12两种氨基酸类阳离子脂质。另一类则以环氧氯丙烷为原料，通过酸催化开环反应、叔胺反应、醚化和季铵盐化反应，合成TMA-Apd-di-C12和HEDMA-Apd-di-C12两种丙二醇胺类阳离子脂质。
　　 采用超声波分散技术，将自合成的阳离子脂质分散成阳离子脂质体，再将脂质体与装载EGFP的质粒DNA混合制备成脂质体/DNA复合物。用Zetasizer Nano ZS激光粒度仪测定了各阳离子脂质体和脂质体/DNA复合物的平均粒径、粒径分布和Zeta电位，用原子力显微镜观察阳离子脂质体及其DNA复合物的形态。结果表明各脂质体及其DNA复合物均有适用于细胞转染的平均粒径，脂质体尺寸为60-150nm，脂质体/DNA复合物为100-350 nm;原子力显微镜表明脂质体及其DNA复合物呈微球形态。通过凝胶阻滞实验，研究阳离子脂质体与质粒DNA的结合能力和确定各脂质体/DNA复合物N/P比范围。实验结果显示，随着复合物中转染试剂比例（即N/P比）的增加，DNA延滞作用明显增强。当N/P比增至2时，各脂质体与质粒DNA已完全结合。
　　 以自合成的四种阳离子脂质体为基因载体，分别对HEK293、A549、U251、Huvec、Ges-1、Hct116、HeLa、GC-1、HBL-100、SW480、FT293、NIN3T3、MCF-7和HT1080十四种细胞系进行转染试验，转染效果与商用转染试剂LipofectamineTM2000(Lipo2000)进行阳性对照。结果显示，四种阳离子脂质体在大部分细胞系中的转染效率与Lipo2000相当或优于Lipo2000。用MTT法对各脂质体的细胞毒性进行检测。结果显示，自合成的氨基酸类阳离子脂质和丙二醇胺类阳离子脂质有低于Lipo2000的细胞毒性。
　　 自合成的四种阳离子脂质体表现出较高的转染效率和低细胞毒性，有进行体外转染和基因治疗的潜力;为非病毒性载体阳离子脂质的研究提供参考。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 基因治疗及基因载体简介

1．2 阳离子脂质体简介

1．3 阳离子聚合物载体

1．3．1 多聚赖氨酸

1．3．2 聚乙烯亚胺

1．3．3 树枝状聚合物

1．3．4 壳聚糖

1．4 论文的研究思路和主要内容

第二章 氨基酸类和丙二醇胺类阳离子脂质的设计与合成

2．1 阳离子脂质分子的设计

2．1．1 氨基酸类衍生物阳离子脂质的合成

2．1．2 丙二醇胺类阳离子脂质的合成

2．2 试剂与仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验内容

2．3．1 氨基酸类阳离子脂质(TMA-β-Ala-di-C12)的合成

2．3．2 氨基酸阳离子脂质(TMA-Val-di-C12)的合成

2．3．3 丙二醇胺类阳离子脂质(TMA-Apd-di-C12)的合成

2．3．4 丙二醇胺类阳离子脂质(HEDMA-Apd-di-C12)的合成

2．4 结果与讨论

2．4．1 氨基酸类阳离子脂质的合成

2．4．2 丙二醇胺类阳离子脂质的合成

第三章 阳离子脂质体纳米粒子、脂质体／DNA复合物的制备及其性能测试

3．1 试剂与仪器

3．2 实验内容

3．2．1 阳离子脂质体纳米粒子的制备

3．2．2 脂质体／DNA复合物的制备

3．2．3 阳离子脂质体纳米粒子的粒径和表面电势的测定

3．2．4 脂质体／DNA复合物的粒径和表面电势的测定

3．2．5 阳离子脂质体及其复合物纳米颗粒的表面表征

3．3 结果与讨论

3．3．1 阳离子脂质体纳米粒子的制备

3．3．2 脂质体／DNA复合物的制备

3．3．3 阳离子脂质体纳米粒子的粒径和表面电势的测定

3．3．4 脂质体／DNA复合物的粒径和表面电势的测定

3．3．5 脂质体及脂质体／DNA复合物的表面形貌的测定

第四章 阳离子脂质体／DNA复合物的体外转染与毒性研究

4．1 主要仪器和试剂

4．2 实验内容

4．2．1 细胞培养

4．2．2 凝胶电泳阻滞实验

4．2．3 体外转染

4．2．4 细胞计数

4．2．5 细胞毒性实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 凝胶电泳阻滞实验

4．3．2 体外细胞转染实验

4．3．3 细胞计数

4．3．4 影响体外细胞转染的因素

4．3．5 细胞毒性实验

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录一

附录二 典型化合物核磁谱图

致谢

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