甲型副伤寒沙门氏菌菌体适配体的筛选及应用研究

摘要

沙门氏菌是世界上报道频率最高，对全球的经济和人们的健康都产生严重危害的一种食源性肠道致病菌。其致病机理是通过寄生在动物肠道内，再经肠系膜淋巴系统进入到血液循环中，在肠道和血液内大量繁殖并释放内毒素，对肠道粘膜、肠壁以及肠壁的神经、血管产生强烈的刺激作用，从而引发消化道疾病，常见的疾病有慢性肠炎和败血症。在2500多种沙门氏菌血清型中，耐抗生素的甲型副伤寒沙门氏菌是伤寒沙门氏菌典型代表，正成为危害亚洲地区的一个新兴的公共卫生难题。
　　 核酸适配体是一段单链寡核苷酸片段，可以通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到。适配体具有价格低廉、易合成、稳定性能好等特点，能够与金属离子、蛋白质、病毒、细菌、肿瘤细胞等各种靶标物质特异性结合。
　　 碳纳米管是一类优良的具有独特的空间结构及独特的化学、电学、力学性质的纳米材料。最近，许多研究表明通过一种自组装原理碳纳米管能够保护ssDNA在细胞水平的传递，通过核酸的碱基与单臂碳纳米管管壁芳香烃环形成π-叠加作用力，ssDNA能缠绕在单臂碳纳米管上，同时增强了单臂碳纳米管的分散性能。单臂碳纳米管的这些独特性能使得它成为一种新型的诊断分析工具。并且基于适配体与单臂碳纳米管间的非共价作用用于生物大分子的检测已经有了报道。
　　 本论文主要开展并完成了一下工作内容:
　　 1、通过体外细胞SELEX筛选技术，构建了全长为79nt、中间随机区域为40nt的ssDNA文库（库容量为280个ssDNA分子），以甲型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi A)为靶标，采用肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和亚利桑那沙门氏菌作为消减筛选靶标，进行了4轮消减筛选及13轮常规筛选，成功筛选到一组能高特异性结合S.paratyphi A的核酸适配体。
　　 2、利用分子克隆技术，对最后一轮筛选得到的核酸适配体的PCR产物进行克隆，随机选取100个单克隆子进行测序。最后，一共获得了27条核酸适配体序列，并对它们进行一级结构的同源性分析及二级结构的模拟分析。用荧光分析法对其亲和力进行测定，它们的KD值达到0～100nM范围，亲和力最高的适配体Apt22的KD值为47±3nM;选择特异性实验分析表明，筛选得到的适配体与S.paratyphiA的结合具有很强的特异性且对同种属的沙门氏菌不会有交叉结合;用FITC荧光标记的适配体对S.paratyphi A进行定量分析，结果表明在细菌浓度为104～108cfu/ml之间呈现出良好的线性关系;最后，还用FITC标记的适配体成功对S.paratyphi A进行了激光扫描共聚焦显微镜细胞成像分析。
　　 3、利用“ssDNA分子可通过非共价自组装的方式缠绕在单臂碳纳米管上，当加入特异性作用底物时，该ssDNA分子会从单臂碳纳米管上脱离下来”这一原理，本研究通过使用DNA酶序列作为信号扩增工具，构建了基于单臂碳纳米管与适配体探针特异、高效、便捷、廉价的甲型副伤寒沙门氏菌检测平台。对适配体Apt22修饰上一段DNA酶序列作为检测探针，通过测量420nM处的化学发光强度的大小来实现靶标细菌的定量检测。该方法对S.paratyphi A的检测限为102cfu/ml，且在细菌浓度为103～107cfu/ml的范围内，检测信号呈线性关系。
　　 本研究表明，沙门氏菌特异性核酸适配体在食品、临床样品、环境样品等实际样品中沙门氏菌的检测中具有巨大的应用潜力。

目录

摘要

1 引言和文献综述

1．1 沙门氏菌

1．1．1 沙门氏菌的概述

1．1．2 沙门氏茵的致病机制

1．2 沙门氏菌的检测方法

1．2．1 传统检测方法

1．2．2 以分子生物学为基础的快速检测方法

1．3 核酸适配体(aptamer)

1．3．1 适配体筛选流程

1．3．2 适配体与靶标结合原理

1．3．3 适配体的优势

1．3．4 适配体的应用

1．4 碳纳米材料及其功能

1．5 本课题研究的工作思路

2 Cell-SELEX筛选甲型副伤寒沙门氏菌适配体方法的建立

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 ssDNA文库和引物

2．1．2 细菌的培养及其实验前的准备

2．1．3 实验中所用试剂的配制

2．1．4 其他试剂

2．1．5 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 稀释平板菌落计数(MPN)

2．2．2 甲型副伤寒沙门氏菌适配体筛选步骤

2．2．3 反筛(counter-SELEX)

2．2．4 计算结合率

2．2．5 流式细胞技术分析适配体文库富集程度

2．3 实验结果与分析

2．3．1 各种细菌细胞计数结果

2．3．2 PCR方法的优化

2．3．3 甲型副伤寒沙门氏菌适配体的SELEX筛选

2．3．4 高亲和力适配体的富集

2．4 小结与讨论

3 适配体的克隆、测序、鉴定及分析

3．1 实验材料

3．1．1 培养基

3．1．2 克隆引物

3．1．3 克隆相关试剂

3．1．4 测序

3．1．5 适配体

3．2 实验方法

3．2．1 第十七轮筛选产物的扩增和纯化

3．2．2 PCR纯化产物的克隆

3．2．3 测序

3．2．4 适配体序列分析

3．2．5 适配体与甲型副伤寒沙门氏菌亲和力的测定

3．2．6 流式细胞技术分析适配体与甲型副伤寒沙门氏菌的结合

3．2．7 适配体与甲型副伤寒沙门氏菌的结合分析

3．2．8 适配体特异性的鉴定

3．2．9 激光扫描共聚焦显微镜细胞成像分析

3．3 实验结果与分析

3．3．1 克隆适配体测序结果及分析

3．3．2 适配体的KD值

3．3．3 流式细胞技术分析适配体与甲型副伤寒沙门氏菌的结合

3．3．4 适配体定量分析甲型副伤寒沙门氏菌

3．3．5 适配体特异性的鉴定

3．3．6 激光扫描共聚焦显微镜细胞成像分析

3．4 小结与讨论

4 基于碳纳米材料和适配体探针特异高效地检测甲型副伤寒沙门氏菌的研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验溶液配制

4．3 实验方法

4．3．1 P0与SWNTs最适孵育比例的探究

4．3．2 基于P0／SWNTs复合物对甲型副伤寒沙门氏菌的检测

4．3．3 P0／SWNTs检测体系的选择特异性研究

4．4 实验结果与分析

4．4．1 P0与SWNTs最适孵育比例的探究结果与分析

4．4．2 P0／SWNTs复合物对甲型副伤寒沙门氏菌的检测分析

4．4．3 P0／SWNTs检测体系的选择特异性分析

4．4 小结与讨论

5 结论与展望

5．1 实验结论

5．2 实验展望

参考文献

攻读硕士学位期间撰写、发表的学术论文

致谢

附录

声明