应用多肽毒素探针研究离子通道的结构和功能

摘要

专一性作用于电压门控钠离子通道的天然多肽毒素可作为研究通道结构与功能关系的分子探针。
　　本研究从雷氏大疣蛛和敬钊缨毛蛛毒液中分别鉴定到了两个新的小分子多肽:作用于钠通道亚型Nav1.3的RTX-Ⅶ和作用于细菌钠离子通道的JZTX-27。利用两个多肽毒素作为分子探针，我们分别对Nav1.3通道晚期钠电流的形成机制以及细菌钠通道上的保守神经毒素作用位点作了深入的探讨。
　　在本文的第二章，我们利用RTX-Ⅶ作为分子探针研究了Nav1.3通道的四个结构域在晚期钠电流产生中的作用。RTX-Ⅶ是一个35个氨基酸残基的小分子多肽，MALDI-TOF质谱鉴定RTX-Ⅶ的分子量为4072.68 Da，RTX-Ⅶ序列中的8个半胱氨酸按1-4，2-5，6-7，3-8的连接模式形成四对二硫键。对各哺乳动物钠通道亚型进行活性分析发现RTX-Ⅶ强烈抑制Nav1.3通道和海马神经元钠通道的快失活，诱导通道产生大的晚期钠电流。但高浓度RTX-Ⅶ对Nav1.4，Nav1.5，Nav1.7通道和DRG TTX-R钠通道的电流都没有影响。提示RTX-Ⅶ具有较好的钠通道亚型选择性。RTX-Ⅶ浓度依赖性的诱导Nav1.3通道的晚期钠电流，其半数有效浓度(EC50)约为120 nM。毒素结合到Nav1.3通道和毒素从Nav1.3通道上的洗脱都较慢，其结合时间常数和洗脱时间常数分别为40.9±11.3 s和162.8±39.7 s。
　　I-V曲线显示RTX-Ⅶ在低电压下易化Nav1.3通道的激活，在较强去极化电压下不影响通道的峰电流。毒素处理后Nav1.3通道的峰电流和晚期钠电流具有相同的激活动力学。RTX-Ⅶ使Nav1.3通道的激活动力学向超极化方向漂移，对通道失活的电压依赖性不产生影响，但毒素在失活曲线上诱导了一个稳态成分。与许多Alpha蝎毒类似，RTX-Ⅶ与Nav1.3通道相互作用表现出电压依赖性的解离和重新结合。RTX-Ⅶ从Nav1.3通道上解离具有电压和时间依赖性，而毒素重新结合到Nav1.3通道上只具有时间依赖性。毒素基本不影响Nav1.3通道的失活后恢复动力学。
　　RTX-Ⅶ抑制海马神经元钠通道的失活提示毒素可能引起中枢神经系统超兴奋，小鼠侧脑室注射毒素证实了这一假设。随后我们以Nav1.3通道和海马神经元钠通道作为模型研究了RTX-Ⅶ引起小鼠中枢神经系统兴奋性中毒的原因。RTX-Ⅶ激活了Nav1.3通道在不同速率的斜坡电压下的电流，并导致斜坡电流第一个峰向超极化方向漂移。同时，我们的研究发现RTX-Ⅶ同步增强Nav1.3通道的晚期钠电流和斜坡电流的第二个峰，这两种电流成分存在紧密的线性相关性(R2=0.998)，RTX-Ⅶ激活Nav1.3通道斜坡电流第二个峰的半数有效浓度(EC50)约为0.3μM。RTX-Ⅶ对海马神经元钠通道的斜坡电流产生了与对Nav1.3通道的斜坡电流类似的影响，包括增强斜坡电流的幅度以及诱导斜坡电流的第一个峰向超极化方向显著的漂移。在毒素诱导下海马神经元钠通道斜坡电流的第二个峰的电流幅度只与跨膜电位相关。毒素对通道斜坡电流的影响强烈提示毒素处理使神经元自发性爆发动作电位。电流钳实验证实RTX-Ⅶ诱导海马神经元静息状态下爆发动作电位导致中枢神经系统的兴奋性中毒。
　　RTX-Ⅶ不能诱导Nav1.5通道产生晚期钠电流。通过同源重组将Nav1.3全部四个结构域的电压敏感元件和孔道区替换成Nav1.5通道的相应区域，我们研究了Nav1.3通道各结构域在晚期钠电流产生中的作用。Nav1.3通道的第二结构域和第四结构域孔道区的替换显著降低通道在毒素诱导下产生的稳态晚期钠电流，但不影响毒素对通道的表观亲和力。Nav1.3通道第四结构域电压敏感元件的替换显著改变毒素对通道的结合，Nav1.3通道第一结构域孔道区的替换不影响通道在毒素诱导下产生的稳态晚期钠电流幅度但较小程度的改变了毒素对通道的亲和力，提示RTX-Ⅶ结合在Nav1.3通道神经毒素作用位点3。竞争性实验表明RTX-Ⅶ不与HNTX-Ⅲ竞争Nav1.3通道上的神经毒素作用位点4，对位点3进行单点突变扫描证实该区域的多个氨基酸残基参与毒素的结合。
　　将Nav1.3通道的四个结构域分别重构至Nav1.5通道显示只有结构域四的替换才能回复毒素对嵌合体通道的活性，将Nav1.3通道的全部四个结构域重构至Nav1.5通道构建了四重嵌合体通道1.5/1.3DⅠ-DⅡ-DⅢ-DⅣ chimera，RTX-Ⅶ能够诱导该四重嵌合体通道产生与野生型Nav1.3通道幅度相当的稳态晚期钠电流。随后将Nav1.3通道的第四结构域和其他三个结构域按不同组合重构至Nav1.5通道证实只需将Nav1.3通道的第二和第四结构域重建至Nav1.5通道即可使嵌合体通道在毒素诱导下产生与野生型Nav1.3通道幅度相当的稳态晚期钠电流。
　　本论文的第三章研究了从敬钊缨毛蛛中分离纯化的JZTX-27与细菌钠离子通道NsvBa的相互作用。JZTX-27序列全长34个氨基酸残基，分子量4086.81Da，包含6个半胱氨酸，也是一个抑制剂胱氨酸结(ICK)多肽。在-20 mV的去极化电压下，JZTX-27强烈抑制NsvBa通道的峰电流。然而，高浓度的JZTX-27(10μM)对另外两个细菌钠离子通道NavPz和NavSp的峰电流抑制较少或没有抑制。JZTX-27抑制NsvBa通道峰电流具有浓度依赖性，在去极化电压为-20 mV时毒素抑制NsvBa通道峰电流的半数抑制浓度(IC50)为112 nM。JZTX-27结合到NsvBa通道上非常快(τon=3.1±1.58 s)但其洗脱相对较慢(τoff=41.8±5.4 s)。
　　与许多beta蜘蛛毒素类似，JZTX-27抑制NsvBa通道的峰电流具有电压依赖性。在较低的毒素（0.2μM）浓度下，JZTX-27不抑制通道的外向电流。电压-峰电流抑制率曲线显示0.2μM JZTX-27对NsvBa峰电流的抑制发生在较负的电压范围，整条曲线呈钟形。在-20mV，0mV和+20mV的去极化电压下JZTX-27抑制NsvBa通道峰电流的半数抑制剂量(IC50)分别为112 nM，426 nM和645 nM。0.2μMJZTX-27使NsvBa通道的激活曲线向去极化方向漂移，但对通道的稳态失活不产生明显的影响。
　　JZTX-27与NsvBa通道作用的动力学显示毒素减慢了通道的激活但加速了通道的去激活过程。在去极化电压+100mV至+200mV的范围内，1.5μM JZTX-27显著减慢通道的激活并且结合了毒素的NsvBa通道表现出电压依赖性的激活。对照组NsvBa通道的尾电流在-200mV至-100mV的电压范围内表现出电压依赖性的衰减。1.5μMJZTX-27显著加快了通道在上述电压范围内的去激活并基本消除了这种电压依赖性。我们推测JZTX-27将NsvBa通道稳定在了静息状态。
　　10μM JZTX-27对NavPz通道的峰电流影响很小，将NsvBa通道的S3-S4胞外环替换成NavPz通道的相应区域显著降低毒素对通道的亲和力。相反的，将NavPz通道的S3-S4胞外环替换成NsvBa通道的相应区域使通道对JZTX-27变得敏感，5μM JZTX-27完全抑制嵌合体通道的峰电流。对该区域进行单点突变扫描显示NsvBa通道S3-S4胞外连接环第99位缬氨酸是毒素与通道相互作用的关键残基。对NsvBa通道S3b桨叶结构和S1-S2胞外环上的氨基酸残基进行丙氨酸扫描突变显示着两个区域不参与结合毒素。
　　JZTX-27能够抑制哺乳动物钠通道Nav1.3-Nav1.5，Nav1.7的峰电流，并延缓通道电流的失活相。但毒素不影响DRG TTX-R钠通道以及Nav1.1通道的电流。JZTX-27延缓Nav1.5通道快失活的半有效剂量为0.7μM。
　　综上所述，我们应用RTX-Ⅶ作为分子探针研究Nav1.3通道的晚期钠电流证实了通道的第二结构域和第四结构域协同作用决定了晚期钠电流的幅度，为针对晚期钠电流开发药物用于疾病治疗提供了线索。应用JZTX-27作为分子探针研究NsvBa通道表明在细菌钠通道中也存在哺乳动物钠通道位点4同源的神经毒素作用位点，同时JZTX-27可以用于与NsvBa通道共结晶解析细菌钠离子通道在静息状态下的晶体结构。

目录

摘要

第一章 电压门控钠通道及离子通道多肽毒素探针研究进展

1．1 电压门控钠通道

1．2 电压门控钠通道毒素

1．3 电压门控钠通道研究展望

1．3．1 电压门控钠通道的晶体结构

1．3．2 基于钠通道结构的钠通道药物设计

1．3．3 筛选专一性作用于钠通道亚型的天然活性成分

第二章 钠离子通道Nav1．3晚期钠电流产生机制研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 RTX-Ⅶ分离纯化和序列测定

2．2．2 钠通道嵌合体和突变体的构建

2．2．3 细胞培养和瞬时转染

2．2．4 大鼠背根神经元和海马神经元的急性分离和培养

2．2．5 全细胞膜片钳记录

2．2．6 数据分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 RTX-Ⅶ增强Nav1．3通道的晚期钠电流

2．3．2 RTX-Ⅶ与Nay1．3通道作用的动力学

2．3．3 RTX-Ⅶ脑室注射致小鼠兴奋性中毒的分子机制

2．3．4 Nay1．3通道和Nay1．5通道结构域互换嵌合体的构建和异源表达

2．3．5 Nav1．3通道第二结构域和第四结构域是RTX-Ⅶ诱导通道产生晚期钠电流的关键区域

2．3．6 RTX-Ⅶ不直接作用于Nav1．3通道的第二结构域

2．3．7 重构Nay1．3通道的第二结构域和第四结构域至Nav1．5通道完全回复RTX-Ⅶ的效果

2．3．8 讨论

第三章 一种新的细菌钠离子通道抑制剂的功能研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 毒素的分离纯化与序列测定

3．2．2 细胞培养与冻存

3．2．3 通道嵌合体和突变体的构建

3．2．4 离子通道的瞬时转染

3．2．5 膜片钳电生理检测

3．2．6 数据分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 JZTX-27的分离鉴定以及毒素对细菌钠通道的活性分析

3．3．2 JZTX-27抑制NsvBa通道的峰电流具有电压依赖性

3．3．3 JZTX-27将NsvBa通道稳定在静息状态

3．3．4 NsvBa通道S3-S4胞外连接环是JZTX-27的作用位点

3．3．5 NsvBa通道V99P突变显著影响JZTX-27对通道的亲和力

3．3．6 JZTX-27对哺乳动物钠通道亚型的活性分析

3．3．7 讨论

第四章 进一步的研究设想

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

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