敬钊缨毛蛛毒素与电压门控钠离子通道作用机制研究

摘要

蜘蛛所产生的具有生物活性的多肽毒素，可以选择性地作用于不同的靶标分子，例如电压门控钠离子通道。正是因为蜘蛛多肽毒素具有作用高效性和专一性的特点，故可以用来进行药理学实验研究和药物研究开发实验，同时也可以用作研究其靶标分子结构和功能的工具试剂分子。敬钊缨毛蛛是一类地下穴居的原始蜘蛛，隶属狒蛛科、棒刺蛛亚科、缨毛蛛属，是近年在我国发现的一蜘蛛新种。从其粗毒中分离纯化得到的29个氨基酸残基构成的多肽毒素——敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ，能够有效抑制大鼠背根神经节(ratDRG)上的河豚毒素敏感型和不敏感型电流，其半有效抑制浓度分别为30.2nM和27.6nM。
　　首先，在本课题中，我们深入地研究了敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ的结构和功能，证明了其是一种作用于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的强抑制剂，其对Nav1.4的半有效抑制浓度为5.12nM，强于其对大鼠背根神经节(ratDRG)上的河豚毒素敏感型和不敏感型电流的抑制作用。在对其电压门控钠离子通道亚型选择性的筛选研究过程中，我们选用了四种电压门控钠离子通道亚型，分别为Nav1.3，Nav1.4，Nav1.5和Nav1.7。实验结果表明JZTX-Ⅴ对Nav1.4的抑制作用最强，而对Nav1.5的抑制作用最弱，其半有效抑制浓度分别为:hNav1.3，292±61nM; rNav1.4，5.12±0.87nM，hNav1.5，2.7±0.779μM和hNav1.7，61.7±1.2nM，同时拟合得出的时间常数值为34.01±6.81s(rNav1.4),133.33±27.96s(hNav1.7),48.54±11.35s(hNav1.3)和34.24±8.13s(hNav1.5)，此实验结果可以证明敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ能够高效且快速地作用于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4。
　　敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ(JZTX-Ⅴ)可以有效地抑制Nav1.4的峰电流值，但是在其亚饱和浓度时，敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ对于Nav1.4的稳态激活和稳态失活都无明显作用，但是却可以改变稳态激活和稳态失活曲线的中点斜率。接下来，我们通过化学合成的敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ的单点突变体来研究其和Nav1.4相互作用的生物学活性位点。研究结果表明，一方面，和野生型的敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ相比，三个疏水性残基（W5，M6和W7）的甘氨酸单点突变体可以显著地降低敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ对Nav1.4的峰电流抑制作用。通过希尔方程拟合后，可以得出不同的敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ单点突变体对钠离子通道亚型Nav1.4的半有效抑制浓度为0.313±0.26(W5A)，0.252±0.45(M6A)和1.92±0.31(W7A)μM。和野生型的敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ相比，其半有效抑制浓度分别提高了61(W5A)，49(M6A)和375(W7A)倍。另一方面，和野生型的敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ相比，两个带正电荷的残基（R20和K22）的甘氨酸突变体可以显著降低敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ和Nav1.4的作用。通过希尔方程拟合后，可以得出不同的敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ单点突变体对钠离子通道亚型Nav1.4的半有效抑制浓度为2.1±0.28(R20A)和0.659±0.011(K22A)μM。和野生型的敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ相比，其半有效抑制浓度分别提高了410(R20A)和128倍(K22A)。由此可知，敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ具有两个生物学活性表面，其中一个为疏水性生物学活性表面，由三个疏水性氨基酸残基组成（W5，M6和W7）;而另一个生物学活性表面由带正电荷氨基酸的残基所组成(R20和K22)。根据其同源模建的结构来看，敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ的带正电荷生物学活性表面位于其疏水性生物学活性表面的周围。先前的关于敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ的磷脂实验表明，敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ表面的带正电荷的氨基酸残基有可能参与到毒素和离子通道的结合过程当中，这一点在本实验中得到验证。关于敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ和电压门控钠离子通道的关键位点研究结果表明，在我们突变的61个氨基酸残基中，其包括所有位于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的不同的结构域的不同的胞外连接环，并没有鉴定到对JZTX-Ⅴ的抑制作用改变特别明显的单点突变体，由此可以知道JZTX-Ⅴ不作用于电压门控钠离子通道Nav1.4的胞外连接环上。
　　其次，本论文还研究了β1亚基是否在敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ和Nav1.4的相互作用中起到一定的作用。研究结果表明，首先，β1亚基可以明显调节表达于HEK293细胞上的Nav1.4的动力学特征。再次，我们研究发现β1亚基可以降低敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ和电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的亲和性，也就是说，β1亚基可以阻碍敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ和Nav1.4的作用。
　　再次，本论文还研究了导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4 R222W的离子通道动力学特征，研究结果表明，和野生型的钠离子通道Nav1.4相比，导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4 R222W可以使激活曲线向去极化方向漂移近6mV;这一单点突变体还可以使失活曲线向超极化方向漂移近5mV。这些在离子通道动力学方面的改变，可也加强钠离子通道Nav1.4的失活作用，导致在静息电位下可激活的钠离子通道数目的减少，以至于无法爆发足够的动作电位，最终导致肌肉的麻痹。
　　据临床报道，临床常用药物乙酰脞胺对此类患者毫无疗效，乙酰脞胺的药理作用为改变细胞外的pH值。但是根据我们的研究，这种导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4 R222W和之前发现的此类疾病的单点突变体所不同的是，这类突变体对胞外pH值得变化不敏感，其胞外pH值的变化对其无任何调节作用，由此导致药物乙酰脞胺的对此类患者无任何治疗效果。我们的研究结果解释了为什么突变体Nav1.4 R222W会导致低血钾周期性麻痹以及为什么药物乙酰脞胺的对此类患者无疗效。
　　综上所述，我们的研究实验数据表明，和Nav1.4相关单点突变体可以导致严重肌肉疾病的发生，以及敬钊缨毛蛛毒素Ⅴ是一种可以高效且快速作用于Nav1.4的多肽分子抑制剂，一方面，为研究电压门控钠离子通道的结构和功能提供了一个新的分子试剂，另一方面也为肌肉疾病类药物的开发提供了一个先导分子。

目录

摘要

第一章 蜘蛛毒素与电压门控钠离子通道研究进展

1．1 蜘蛛毒素

1．1．1 蜘蛛简介

1．1．2 蜘蛛毒素研究进展

1．2 电压门控钠离子通道

1．2．1 电压门控钠离子通道的发现

1．2．2 电压门控钠离子通道的结构(Primary structures of soiucm channel subunits)

1．2．3 电压门控钠离子通道的多样性(Diversity of sodium channel subunits)

1．2．4 离子通道的超家族(The ion channel protein superfamily)

1．2．5 钠离子通道的空间结构(Sodium channelstructure at atomic resolution)

1．2．6 电压门控钠离子通道的孔道区(The pore of sodium channels)

1．2．7 电压门控钠离子通道的离子选择性(Ion selectivity and conductance)

1．2．8 钠离子通道上药物结合位点

1．2．9 电压门控钠离子通道激活

1．2．10 电压门控钠离子通道快失活(Fast inactivation)

1．2．11 调控电压门控钠离子通道的功能

1．2．12 电压门控钠离子通道突变体的病理学特征

1．2．13 电压门控钠离子通道β亚基

第二章 JZTX-V与电压门控钠离子通道亚型Nav1．4相互作用的分子机制研究

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 粗毒的获取

2．2．2 试剂和仪器

2．2．3 JZTX-V的野生型和突变体的分离和纯化

2．2．4 异源表达用质粒的准备

2．2．5 电压门控钠离子通道亚型Nav1．4突变体的构建

2．2．6 HEK293细胞异源表达电压门控钠离子通道及其突变体

2．2．7 膜片钳实验

2．3 结果

2．3．1 JZTX-V对异源表达在HEK293细胞上的不同的电压门控钠通道亚型的抑制作用

2．3．2 亚饱和浓度的JZTX-V对野生型电压门控钠离子通道亚型Nay1．4激活和失活的作用

2．3．3 JZTX-V的化学合成

2．3．4 JZTX-V单点突变体的电生理功能分析

2．3．5 JZTX-V和电压门控钠离子通道相互作用关键位点鉴定

2．4 讨论

2．4．1 JZTX-V是电压门控钠离子通道亚型Nav1．4的选择性抑制剂

2．4．2 JZTX-V对电压门控钠离子通道亚型Nav1．4的作用

2．4．3 JZTX-V和电压门控钠离子通道亚型Nav1．4相互作用的生活学活性表面的鉴定

2．4．4 JZTX-V和其他作用了电压门控钠离子通道亚型Nav1．4毒素的比较

2．4．4 JZTX-V和电压门控钠离子通道亚型Nav1．4的关键位点研究

第三章 电压门控钠离子通道β亚基对JZTX-V抑制作用的影响

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 野生型JZTX-V的分离和纯化

3．2．2 质粒

3．2．3 试剂及试剂盒

3．2．4 仪器

3．2．5 TAKARA公司购买预制DH50α大肠杆菌感受态细胞转化方法

3．2．6 转化成功菌落测序以及菌种保存

3．2．7 质粒中量提取

3．2．8 HEK293细胞异源表达电压门控钠离子通道及其突变体

3．2．9 膜片钳实验

3．3 结果

3．3．1 β亚基对电压门控钠离子通道亚型Nav1．4的调节作用

3．3．2 β亚基对电压门控钠离子通道亚型Nav1．4和JZTX-V之间相互作用的影响

3．4 讨论

第四章 低血钾周期性麻痹疾病突变体rNav1．4 R222W的致病机理研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 试剂和仪器

4．2．2 异源表达用质粒的准备

4．2．3 电压门控钠离子通道亚型Nay1．4突变体的构建

4．2．4 HEK293细胞异源表达电压门控钠离子通道及其突变体

4．2．5 膜片钳实验

4．3 结果

4．3．1 电压门控钠离子通道Nav1．4单点突变体R222W对稳态激活过程的影响

4．3．2 电压门控钠离子通道Nav1．4单点突变体R222W对稳态失活过程的影响

4．3．3 胞外pH值对电压门控钠离子通道Nay1．4稳态激活和失活过程的影响

4．3．4 胞外pH值对低血钾周期性麻痹单点突变体Nav1．4 R222W的稳态激活过程的影响

4．3．5 胞外pH值对低血钾周期性麻痹单点突变体Nav1．4 R222W的稳态失活过程的影响

5．4 讨论

第五章 主要研究结论与进一步研究设想

参考文献

缩写表(中英文对照)

论文发表情况

致谢

附录

声明