斑马鱼胚胎细胞体外分化产生黑色素样细胞的研究

摘要

色素细胞为动物提供了华丽斑斓的外表，不仅帮助动物适应生存环境，而且在动物种群内以及物种之间相互作用上有重要作用，也是进化选择的因素之一。黑色素细胞是动物体色素细胞的主要类型之一，内含大量黑色素颗粒，通过吸收特定波长的入射光而呈现黑色。开展黑色素细胞生物学研究有助于进一步解析体色多样性的分子机制、探索体色失常以及黑色素细胞瘤的发育机理。
　　在斑马鱼胚胎细胞的体外培养和建系的研究中，我们发现在含有鱼血清的培养体系中，能够诱导分化出黑色素样细胞。在此基础上，开展了斑马鱼胚胎细胞体外分化产生黑色素样细胞的研究。相关研究内容与结果总结如下:
　　(1)以受精后10小时的斑马鱼胚胎（10hpf，神经胚早期）为材料，进行胚胎细胞的分离和体外培养，获得了斑马鱼体外培养的胚胎细胞;
　　(2)摸索了生长因子、斑马鱼胚胎提取液、鱼血清等不同培养条件对斑马鱼胚胎细胞体外培养的影响，发现鱼血清体外培养条件下，可以诱导斑马鱼胚胎细胞分化出黑色素样细胞;
　　(3)对添加鱼血清后获得到的黑色素样细胞的形态及结构特征进行了显微观察。黑色素样细胞直径约20 u m～200μ m不等，细胞内含有大小不等的黑色素颗粒，细胞呈现黑色。根据形态的不同，黑色素样细胞可以分为圆球状、分枝状以及不规则等不同细胞类型;
　　(4)结合RT-PCR技术，检测了黑色素干细胞标记基因mitfa和黑色素细胞标记基因tyr在鱼血清培养体系细胞中的表达。检测结果显示在鱼血清培养体系细胞中的均检测到mitfa和tyr的表达。表明，鱼血清培养条件下，胚胎细胞可以诱导分化产生黑色素干细胞和黑色素细胞;
　　(5)为进一步了解和掌握鱼血清培养体系中培养细胞的发育状况，利用免疫荧光方法检测了Nestin、Brachyury和Gata4等几种多能性标记因子的表达。结果显示，在培养细胞中检测到Nestin、Brachyury和Gata4阳性表达的细胞，表明鱼血清培养条件下，有黑色素细胞诱导分化的同时，培养体系中仍然有外胚层细胞、中胚层细胞和内胚层细胞等多能性干细胞的存在。
　　综上所述，本研究以体外培养的斑马鱼胚胎细胞为材料，确定了在鱼血清培养条件下能够诱导分化产生黑色素细胞，为进一步建立黑色素干细胞和黑色素细胞分子发育调控机理研究的细胞模型奠定了重要的研究基础。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 细胞体外培养

1．1．1 细胞培养的发展

1．1．2 细胞培养体系的建立

1．2 胚胎干细胞及胚胎细胞系

1．2．1 胚胎干细胞的研究现状

1．2．2 胚胎细胞系的研究与应用

1．3 动物体色及色素细胞研究进展

1．3．1 动物体色

1．3．2 色素细胞和色素细胞发育调控

1．3．3 色素细胞的体外培养和分化

1．4 本文研究内容及意义

第二章 实验材料

2．1 实验鱼

2．2 实验试剂

2．3 鱼血清的制备

2．4 斑马鱼胚胎提取液的制备

2．5 斑马鱼胚胎细胞培养液

第三章 实验方法

3．1 斑马鱼的催产

3．2 斑马鱼胚胎细胞的原代培养及传代冻存和复苏

3．3 斑马鱼胚胎细胞体外分化产生黑色素样细胞的培养

3．4 斑马鱼黑色素样细胞相关基因mitfa和tyr的cDNA克隆

3．4．1 引物设计

3．4．2 鱼血清条件下的斑马鱼胚胎细胞总RNA的提取

3．4．3 cDNA第一链的合成

3．4．4 mitfa和tyr mRNA检测

3．4．5 PCR产物的回收

3．4．6 连接转化

3．4．7 阳性克隆的筛选

3．5 鱼血清培养体系下斑马鱼胚胎细胞的多能性鉴定

第四章 实验结果

4．1 斑马鱼胚胎细胞的体外培养

4．1．1 斑马鱼胚胎细胞的原代和继代培养

4．1．2 不同培养体系下斑马鱼胚胎细胞的体外培养

4．1．3 有无鱼血清对斑马鱼胚胎细胞分化的影响

4．2 鱼血清条件下产生的黑色素样细胞的显微观察

4．2．1 鱼血清条件下黑色素样细胞的形态观察

4．2．2 鱼血清条件下黑色素样细胞的传代

4．3 鱼血清培养条件下胚胎细胞的mitfa和tyr基因表达分析

4．3．1 斑马鱼黑色素样细胞相关基因mitfa和tyr的cDNA克隆

4．3．2 斑马鱼黑色素样细胞相关基因mitfa和tyr的mRNA检测

4．3．3 黑色素前体细胞标记基因mitfa的鉴定

4．3．4 黑色素细胞标记基因tyr的鉴定

4．4 鱼血清培养体系下斑马鱼胚胎细胞的多能性鉴定

第五章 实验讨论

参考文献

硕士学习期间发表论文情况

致谢

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