突变型p53与HSP70和HSP90的相互作用的研究

摘要

TP53基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为p53。TP53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。TP53突变大多是由于单个氨基酸发生替换而导致的错义突变。突变p53蛋白依然保留着全长序列，但是功能上却从抑癌基因转变为癌基因。
　　热休克蛋白(HSP)是生物受到环境中物理、化学、生物、精神等刺激时发生应激反应而合成的蛋白质，是一类高度保守的蛋白质，普遍存在于原核和真核生物中。HSP家族的功能十分重要，主要作为分子伴侣、影响细胞凋亡、参与免疫和提高细胞耐热性。
　　在本文中，我们首先通过免疫共沉淀结合质谱分析的方法在含有p53R273H突变体的乳腺癌细胞MDA-MB-468中鉴定与p53R273H相互作用的蛋白质，一共鉴定到59个与p53R273H相互作用的蛋白。其中有9个蛋白为热休克蛋白，其中属于HSP70家族的有HSP70A2、HSP70A5、HSP70A6、HSP70A7、HSP70A8、HSP70A1L，属于HSP90家族的为HSP90AA1、HSP90AB1、HSP90B1。
　　然后，我们研究HSP70和HSP90对p53R273H蛋白功能的影响。我们将HSP90-AB1表达质粒和一个HSP70-A5表达质粒与p53R273H表达质粒共转入Hek293细胞中，然后检测p53R273H蛋白的稳定性。结果表明，HSP70和HSP90都能增强p53R273H的稳定性，而且HSP70与HSP90共转染比单独转染一种质粒时p53R273H的稳定性更好。而用HSP70的抑制剂Pifithrin-μ或/和HSP90的抑制剂17-AAG处理MDA-MB-468细胞，则促进p53R273H蛋白的降解。进一步研究表明，在MDA-MB-468细胞中干扰p53R273H突变体抑制细胞增殖，用HSP70的抑制剂Pifithrin-μ或/和HSP90的抑制剂17-AAG处理MDA-MB-468细胞，抑制细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡。这些结果说明，HSP70和HSP90可能通过与p53R27H蛋白的相互作用、促进p53R27H蛋白的稳定，从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。

目录

摘要

英文缩写表

1 前言

1．1 p53的结构和功能

1．2 突变型p53的概述

1．2．1 突变型p53的类型

1．2．2 突变型p53的功能获得

1．3 HSP家族

1．3．1 HSP家族的分类与表达

1．3．2 HSP家族的功能

1．3．3 HSP70的概况

1．3．4 HSP90的概况

1．4 HSP70、HSP90与p53

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞株和菌种

2．1．2 载体和工具酶

2．1．3 试剂盒

2．1．4 抗体

2．1．5 细胞培养基

2．1．6 药品和试剂

2．1．7 溶液配制

2．2 RNA提取与反转录

2．3 质粒构建

2．4 免疫共沉淀结合质谱分析筛选p53R273H相互作用蛋白

2．4．1 免疫共沉淀

2．4．2 蛋白质的银染

2．4．3 银染蛋白质点酶解步骤

2．5 蛋白质印迹

2．5．1 提取细胞总蛋白

2．5．2 Western-blotting

2．6 MTT法检测细胞生长抑制试验

2．7 流式细胞仪检测细胞凋亡

2．8 统计学分析

3 结果与分析

3．1 免疫共沉淀结合质谱分析筛选p53R273H相互作用蛋白

3．2 HSP70和HSP90抑制p53R273H蛋白的降解

3．3 p53R273H蛋白促进细胞增殖

3．4 HSP70和HSP90促进乳腺癌细胞增殖、抑制细胞凋亡

3．5 HSP70和HSP90促进细胞迁移

4 讨论

参考文献

致谢

声明